遺傳病的分析4基因組dna提取與pcr擴(kuò)增技術(shù)

1、遺傳病的分析4基因組DNA提取與PCR擴(kuò)增技術(shù),,一、基因組DNA提取,,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?基因組DNA的制備是基因分析的前提。本實(shí)驗(yàn)要求掌握基因組DNA提取的基本方法。,原 理,DNA在生物體內(nèi)是與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的形式存在的。核酸與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合力包括離子鍵、氫鍵、范德華力等，破壞或降低這些結(jié)合力就可把核酸與蛋白分開(kāi)。 DNA、RNA所含有的嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵具有吸收紫外光的性質(zhì)，吸收高峰在260nm處，所以

2、，可用紫外分光光度法測(cè)定DNA的濃度。,原理,基因組DNA提取試劑盒：在高鹽的狀態(tài)下，DNA純化樹(shù)脂專一性地吸附DNA；而在低鹽或水溶液狀態(tài)下，DNA被洗脫下來(lái)。,器材與試劑,臺(tái)式高速離心機(jī)、天平、水浴恒溫箱、移液槍、塑料離心管等試劑盒（純化樹(shù)脂、GN結(jié)合液、漂洗液、無(wú)水乙醇、離心純化柱 ）、TE緩沖液,操作,1、將全血輕輕混勻，轉(zhuǎn)移0.5ml全血到1ml純化樹(shù)脂中，顛倒混勻5-6次，室溫，3min。其間要顛倒混勻1次，5000r/m

3、in離心×3sec；2、取沉淀，加1mlGN結(jié)合液懸浮沉淀，顛倒混勻， 5000r/min離心×3sec；3、取沉淀，加0.5ml漂洗液純化樹(shù)脂2次，顛倒混勻， 5000r/min離心×3ecs；4、取沉淀， 加0.8ml無(wú)水乙醇懸浮沉淀，顛倒混勻；裝入離心純化柱，12000r/min離心×1min，棄乙醇液；5、空柱再12000r/min離心×1min，進(jìn)一步棄乙醇液；6、取

4、離心好的純化柱套入一干凈的1.5ml離心管中，加入100ul TE緩沖液于純化樹(shù)脂上（不能粘在管壁上），室溫下放置3min，12000r/min離心×2min。,注意事項(xiàng),一般情況下，純凈的DNA OD260/OD280比值約為1.8，RNA為2.0。若樣品中含蛋白質(zhì)，則比值下降，必要時(shí)需重新抽提。若DNA的比值<1.75，則加入SDS至0.5%；從核酸中去除蛋白質(zhì)時(shí)，常用到酚：氯仿等體積混合液。氯仿的作用是使蛋白質(zhì)變

5、性并有助于水相和有機(jī)相的分離；DNA用TE溶解，可增加DNA的穩(wěn)定性，便于長(zhǎng)期保存。,二、PCR擴(kuò)增技術(shù),,實(shí)驗(yàn)原理,多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)的原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程?？珊?jiǎn)述為：在微量離心管中加入適量緩沖液，加入微量模板DNA，四種脫氧核苷酸（dNTP），和耐熱Taq聚合酶及兩個(gè)合成的DNA引物，并有Mg2+存在。,實(shí)驗(yàn)原理,加熱使模板DNA在高溫下（94℃）變性，雙鏈解鏈，這是所謂變性階段。降低溶液溫度，使合成引物在低

6、溫（56℃）與模板DNA互補(bǔ)退火形成部分雙鏈，這是所謂退火階段。溶液反應(yīng)溫度升至中溫（72℃），在Taq酶作用下，以四種dNTP為原料，引物為復(fù)制起點(diǎn)，模板DNA的一條雙鏈在解鏈和退火之后延伸為兩條雙鏈，這是延伸階段。如此反復(fù)，在同一反應(yīng)體系中可重復(fù)高溫變性、低溫復(fù)性和DNA合成這一循環(huán)，使產(chǎn)物DNA重復(fù)合成，并且在重復(fù)過(guò)程中，前一循環(huán)的產(chǎn)物DNA可作為后一循環(huán)的模板DNA而參與DNA的合成，使產(chǎn)物DNA的量按2n方式擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)25

7、～35個(gè)循環(huán)，DNA擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)106～109。,實(shí)驗(yàn)原理,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?本實(shí)驗(yàn)以所提出的全血基因組DNA為模板，以線粒體基因上一段核苷酸為引物，擴(kuò)增出924bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。學(xué)習(xí)并掌握PCR 反應(yīng)的基本原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)。,器材和試劑,器材 PCR擴(kuò)增儀，旋渦振蕩器，臺(tái)式離心機(jī)，加樣槍及槍頭等,器材與試劑,試劑： 1、PCR試劑盒： （Taq DNA 聚合酶、 dNTP 、Mg＋＋等） 2、引物 1（

8、68kb上游） 引物 2（69kb下游） 3、無(wú)菌ddH2O 4、模板DNA：為本次實(shí)驗(yàn)所提出的全血基因組 DNA,操作,無(wú)菌ddH2O 21.5ulTaq酶等 25ul引物1（68） 0.6ul引物2 （69） 0.9ul模板DNA 2ul 混勻后，離心

9、5000r/min×1min，置PCR儀,總體積50ul,,操作,PCR擴(kuò)增的設(shè)定：設(shè)置PCR擴(kuò)增儀的熱蓋溫度為100℃預(yù)變性：94℃5min循環(huán)： 94℃變性30s 56℃退火30s 30個(gè)循環(huán) 72℃延伸30s末次延伸：72℃ 5min4 ℃保存,,,注意事項(xiàng),由于PCR技術(shù)非常敏感，可使一個(gè)DNA分子得以擴(kuò)增，裝有PCR試劑的微量離