甲醛誘導(dǎo)雌性大鼠卵巢及子宮毒性研究.pdf

1、甲醛(formaldehyde，F(xiàn)A)，又名蟻醛，分子式為CH3CHO，含有一不飽和羰基，具有強(qiáng)氧化性，化學(xué)性質(zhì)非?；顫姟＜兹V泛地存在人們的衣食住行中，如室內(nèi)裝修材料、印刷油墨、紡織纖維、化妝品、殺蟲劑、清潔劑、消毒劑、防腐劑及各種燃料的燃燒中均不同程度地含有甲醛。特別是近20多年來，隨著我國大規(guī)模開發(fā)建筑裝飾、房屋市場，使得人們接觸甲醛的機(jī)會(huì)比以往大大增加。據(jù)報(bào)道，在室內(nèi)裝修材料內(nèi)含有的脲醛樹脂可緩慢釋放低濃度甲醛幾年甚至幾十年，可

2、對人體的健康造成潛在的遠(yuǎn)期危害。
　　 體外實(shí)驗(yàn)表明，甲醛是一種遺傳毒性致癌物，可誘導(dǎo)外周血淋巴細(xì)胞、人白血病細(xì)胞(HL-60)、肺巨噬細(xì)胞、睪丸細(xì)胞等細(xì)胞發(fā)生DNA雙鏈斷裂損傷(DSB)，而且隨著甲醛濃度的增加，細(xì)胞主要呈現(xiàn)出DNA-DNA、DNA-蛋白質(zhì)(DPC)的交聯(lián)效應(yīng)。流行病學(xué)研究亦證實(shí)，長期低濃度甲醛接觸可導(dǎo)致眼和呼吸道炎癥、支氣管哮喘、神經(jīng)行為異常及鼻咽癌、肺癌等疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加。對雌性個(gè)體，甲醛還可致不孕(Inf

3、ertility)、死胎(Stillbirth)及胎兒畸形(Fetal malformation)等生殖毒性。但目前，甲醛誘導(dǎo)雌性動(dòng)物生殖毒性的生物學(xué)機(jī)制仍未完全清楚，特別是在低劑量接觸條件下，從細(xì)胞分子水平上闡明甲醛的毒性機(jī)制顯得尤為必要。卵巢與子宮是雌性動(dòng)物發(fā)揮生殖功能的重要器官，通過卵巢組織中卵原細(xì)胞的有絲分裂及減數(shù)分裂，從而形成成熟的卵母細(xì)胞(卵子)，并經(jīng)輸卵管進(jìn)入子宮等待受精，如果雌性個(gè)體在性成熟期受到甲醛的毒性作用，那么卵母

4、細(xì)胞的發(fā)育、成熟及受精均會(huì)受到影響，有可能會(huì)出現(xiàn)流產(chǎn)(abortion)、死胎等難以預(yù)測的嚴(yán)重后果。
　　 因此，我們以雌性SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對象，分別進(jìn)行低、中、高不同濃度甲醛染毒處理，收集大鼠的血清、卵巢及子宮組織，分別從卵巢儲(chǔ)備功能、卵巢組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)、組織中細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)等方面闡述了甲醛對雌性大鼠卵巢及子宮產(chǎn)生損傷的細(xì)胞及分子毒理學(xué)特征，為甲醛雌性生殖毒性機(jī)制的闡明提供參考依據(jù)。
　　 第一部分

5、、甲醛對雌性大鼠卵巢功能及組織結(jié)構(gòu)的毒性研究
　　 (一)甲醛對雌性SD大鼠卵巢儲(chǔ)備功能的影響
　　 目的：探討甲醛對雌性SD大鼠卵巢儲(chǔ)備功能的毒性作用。
　　 方法：將40只SD雌性大鼠隨機(jī)分為正常對照組和3個(gè)不同濃度(0.2、2.0、20.0 mg/kg)的甲醛染毒組。腹腔注射甲醛染毒，每天1次，連續(xù)染毒14天，14天后采用股動(dòng)脈放血法處死受試動(dòng)物，并收集血清，用化學(xué)發(fā)光法測定血清雌二醇(E2)濃度；用酶聯(lián)免

6、疫方法測定抑制素B(inhibin B)濃度；用放射免疫方法測定卵泡刺激素(FSH)和黃體生成激素(LH)的濃度。同時(shí)解剖摘取卵巢稱重，計(jì)算臟器系數(shù)。
　　 結(jié)果：甲醛染毒組與對照組比較，各染毒劑量組大鼠血清E2、Inhibin B水平明顯降低(P<0.05)，F(xiàn)SH水平顯著升高(P<0.05)；高、中劑量組大鼠血清LH水平均有所升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各染毒劑量組卵巢臟器系數(shù)顯著降低(P<0.05)。

7、　　 結(jié)論：甲醛對SD雌性大鼠卵巢儲(chǔ)備功能有一定損害作用。
　　 (二)甲醛對雌性SD大鼠卵巢組織和細(xì)胞顯微及超微結(jié)構(gòu)的影響
　　 目的：研究甲醛對雌性大鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)、卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞的顯微及超微結(jié)構(gòu)的影響。
　　 方法：將40只SD雌性大鼠隨機(jī)分為正常對照組和3個(gè)不同濃度甲醛染毒組，腹腔注射甲醛，劑量分別為20.0、2.0和0.2 mg/kg，每天1次，連續(xù)14天，14天后處死所有大鼠取卵巢組織，應(yīng)用HE

8、染色光鏡觀察雌性大鼠卵巢組織病理形態(tài)變化，應(yīng)用電鏡技術(shù)觀察雌性大鼠卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，應(yīng)用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL)檢測卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞凋亡的情況。
　　 結(jié)果：甲醛可引起雌性大鼠卵巢組織發(fā)生病理學(xué)改變，如卵巢皮質(zhì)輕度萎縮、結(jié)構(gòu)紊亂，間質(zhì)小血管擴(kuò)張充血及纖維組織增生等病理改變，其病理變化程度與甲醛呈劑量依賴性；電鏡檢查發(fā)現(xiàn)甲醛可破壞卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)細(xì)胞核模糊、不規(guī)則，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體數(shù)量

9、明顯減少，線粒體腫脹及嵴模糊，以及核膜皺縮、染色質(zhì)邊集、核仁變小或消失等細(xì)胞早期凋亡特征。其細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化的程度與甲醛亦呈劑量依賴性；TUNEL染色觀察發(fā)現(xiàn)甲醛染毒組大鼠卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的凋亡率均高于對照組，且中、高劑量組和對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：甲醛對雌性大鼠的卵巢組織結(jié)構(gòu)、卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)造成不良影響，促使卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞呈凋亡發(fā)展趨勢。
　　 第二部分、甲醛誘導(dǎo)

10、雌性大鼠卵巢組織Fas凋亡途徑基因及蛋白表達(dá)變化
　　 目的：觀察甲醛對雌性大鼠卵巢組織Fas，半胱氨酸蛋白酶caspase-8和caspase-3表達(dá)的影響，探討甲醛對雌性大鼠卵巢毒性的分子機(jī)制。
　　 方法：將40只雌性SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組和3個(gè)不同濃度甲醛處理組，腹腔注射甲醛，劑量分別為20.0、2.0和0.2 mg/kg，每天1次，連續(xù)14天后處死所有大鼠后取卵巢組織，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢

11、測Fas和半胱氨酸蛋白酶(caspase-8)mRNA表達(dá)，免疫印跡法(Western-Blot)檢測Fas蛋白表達(dá)，分光光度法(UV-visible spectrophotometry)檢測caspase-8和caspase-3的活性。
　　 結(jié)果：甲醛染毒組卵巢組織Fas與caspase-8 mRNA表達(dá)以及caspase-8和caspase-3活性明顯高于對照組，且隨劑量的增加而增加(P<0.05)。
　　 結(jié)論：

12、Fas基因表達(dá)與caspase活性增強(qiáng)可能是甲醛誘導(dǎo)雌性動(dòng)物卵巢毒性的重要機(jī)制。
　　 第三部分、甲醛對雌性SD大鼠卵巢及子宮組織線粒體依賴性細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的干擾效應(yīng)
　　 目的：觀察甲醛對雌性大鼠卵巢及子宮組織線粒體依賴性細(xì)胞凋亡途徑相關(guān)基因VDAC1、ANT1、hOGG1 mRNA表達(dá)水平的影響。
　　 方法：將20只雌性SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組和3個(gè)不同濃度甲醛處理組，腹腔注射甲醛，劑量分別為40.

13、0、4.0和0.4 mg/kg，每天1次，連續(xù)5天后處死所有大鼠，取卵巢組織及子宮組織，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR法(RT-qPCR)檢測了電壓依賴性陰離子通道(VDAC1)、腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ANT1)、8-羥基鳥嘌呤糖苷酶(hOGG1)基因的mRNA表達(dá)水平變化。
　　 結(jié)果：甲醛染毒處理后，在卵巢和子宮組織，VDAC1、ANT1基因mRNA表達(dá)水平明顯增加，其中子宮組織相比而言增加較為明顯，在低、中、高劑量組織均明顯增加(P<

14、0.05)。而對于hOGG1而言，卵巢和子宮組織表達(dá)相類似，在低劑量甲醛組，hOGG1 mRNA表達(dá)變化不明顯，在中、高劑量甲醛處理組，hOGG1 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)。
　　 結(jié)論：甲醛可誘導(dǎo)雌性大鼠卵巢及子宮組織VDAC1、ANT1mRNA表達(dá)水平異常增加以及氧化損傷修復(fù)基因hOGG1 mRNA表達(dá)明顯降低，可能與線粒體損傷誘發(fā)的細(xì)胞凋亡程序激活有關(guān)。
　　 綜上三個(gè)部分所述，在不同劑量甲醛染毒條件下

15、，甲醛可誘導(dǎo)雌性大鼠卵巢儲(chǔ)備功能產(chǎn)生損害，主要表現(xiàn)為血清雌二醇(E2)、抑制素B(inhibin B)濃度明顯降低，而卵泡刺激素(FSH)水平明顯升高。同時(shí)甲醛可對大鼠卵巢組織、卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞產(chǎn)生病理性損害，引起卵巢皮質(zhì)萎縮、結(jié)構(gòu)紊亂，纖維組織增生等病理改變以及卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)細(xì)胞核膜皺縮、線粒體腫脹、核仁變小或消失等早期細(xì)胞凋亡特征。在分子水平上我們亦發(fā)現(xiàn)甲醛可誘導(dǎo)大鼠卵巢或子宮組織Fas凋亡途徑及線粒體依賴性細(xì)胞