spo0A基因缺失對克勞氏芽孢桿菌發(fā)酵性能的影響.pdf

1、克勞氏芽孢桿菌（Bacillus clausii）是一株應用于工業(yè)化生產的高產堿性蛋白酶菌株，生產過程中芽孢的形成對后期的發(fā)酵和產酶有較大的影響，相對的增加了成本，降低了收益。利用基因組學和功能基因組學技術，分析芽孢形成過程中的基因調控機制以及構建高產芽孢缺失型菌株成為可能，而芽孢的形成過程是一個多層次分階段的過程，研究發(fā)現(xiàn)spo0A、kinA、kinB以及δ因子等基因在芽孢形成過程中起著重要作用。文對堿性蛋白酶的基本特性、芽孢形成初始

2、階段的基因調控機制以及實驗中采用的基因敲除技術進行了綜合分析；實驗中完成了對克勞氏芽孢桿菌的菌株特性、敲除了upp基因實現(xiàn)了反向篩選標記的構建、敲除了spo0A基因，分析spo0A基因對克勞氏芽孢桿菌的影響。
　　本研究主要內容包括：⑴針對該菌株不同于嗜堿芽孢桿菌的特性，本研究對克勞氏芽孢桿菌進行了16rDNA分析，按照基因組提取試劑盒提取基因組，PCR擴增出目標片段后送上海生工測序，將測序結果在GeneBank中BLAST比對，

3、結果表明該菌株與克勞氏芽孢菌屬重合度達到100％。同時對菌株的菌落形態(tài)、染色形態(tài)、培養(yǎng)條件、產酶、培養(yǎng)條件以及相關抗性等特性進行了分析。⑵根據(jù)克勞氏芽孢桿菌轉化效率較低的特點，利用溫敏型質粒作為載體，進而實現(xiàn)該質粒在改變培養(yǎng)溫度后復制狀態(tài)轉變成自殺質粒。在提取克勞氏芽孢桿菌的基因組后利用upp基因的上下游同源臂引物擴增兩片段，再利用重疊PCR技術將上下游同源臂拼接，測序驗證后連接于溫敏型質粒pKSV7上，轉化誘導后敲除了upp基因進而成

4、功構建了upp缺失型菌株，實現(xiàn)了upp基因的無痕敲除和upp反向篩選標記的構建。實驗中分析了 upp敲除菌株的5-氟尿嘧啶抗性來驗證該菌株是否具有反向篩選功能。⑶以upp敲除菌株為宿主菌株，利用upp作為反向篩選標記并結合溫敏型質粒pKSU敲除芽孢形成的關鍵基因spo0A，分析構建的Δspo0A菌株產酶及其他的相關特性。其中，構建upp的缺失菌株作為敲除實驗的初始菌株，質粒pKSU用來在42℃中獲得單交換菌株，5-氟尿嘧啶用來篩選雙交換