海洋酸化對海洋青鳉魚性腺分化的影響.pdf

1、工業(yè)革命之后，來自于化石燃料的燃燒和人類活動的影響，大氣中CO2濃度不斷增加。其中排放到大氣中的24％到35%的CO2被海洋吸收，是引起海水酸度增加和碳酸鹽平衡體系改變的主要原因，當前表層海水的pH已經(jīng)比工業(yè)革命時期降低了0.1個單位。到2100年大氣CO2的濃度升高至800~1000μL/L（μtam）?？茖W家們已經(jīng)意識到過量排放CO2正在改變海洋生物賴以生存的水環(huán)境，隨著海洋中溶解的CO2日益增多，海水化學環(huán)境的改變，生活在廣闊無邊

2、的海洋中的生物也是深受其害，很可能會對海洋生物生長發(fā)育有影響，甚至影響魚類繁殖后代。因此開展對海水中CO2溶量對魚類影響研究具有重要意義。
　　海洋青鳉魚（Oryzias melastigma）隸屬于脊索動物門（Chordata）脊椎動物亞門(Vertebrate)輻鰭亞綱鳉形目(Cypernodontiformes)青鳉屬(Oryzias)。海水青鳉魚與日本青鳉魚的發(fā)育上很是接近，當前日本青鳉魚的解剖和生理方面的研究已經(jīng)比較完善

3、和系統(tǒng)，這便為海洋青鳉魚的對應(yīng)研究提供了便利，同時也使海洋青鳉魚成為海水生態(tài)毒理學研究的模式生物。海洋青鳉魚個頭較小容易在實驗室條件下進行大規(guī)模飼養(yǎng)。雌雄第二性征明顯，性別差異可通過臀鰭的形態(tài)不同進行快速的辨別；且雌魚產(chǎn)卵量大，世代周期短；魚卵的體積較大，顏色透明且不易破損，發(fā)育各階段變化明顯，極易進行各種實驗室觀察和操作。
　　本文主要研究海洋酸化對青鳉魚性腺發(fā)育及性別分化的影響。首先通過爆CO2模擬海洋酸化水環(huán)境處理成年青鳉魚

4、，觀察酸化對其受精率的影響，并通過免疫組化和WB的方法觀察酸化對成年青鳉魚腦部c-fos蛋白的表達區(qū)域和表達量的影響。其次研究酸化對受精卵胚胎發(fā)育以及性腺發(fā)育的影響。最后，我們通過H.E.切片染色觀察海洋青鳉魚性腺發(fā)育階段。
　　對成年海洋青鳉魚生存環(huán)境中通入CO2發(fā)現(xiàn)c-fos蛋白在海洋青鳉魚的大部分腦區(qū)，尤其端腦，視頂蓋和延腦三個腦區(qū)內(nèi)均能檢測到。通入CO2處理和對照組的對比結(jié)果，可以初步得出結(jié)論，CO2對青鳉魚腦中的c-fo

5、s表達具有一定的影響，使得c-fos的表達水平上調(diào)，并在不同的腦區(qū)存在差異，由于端腦有接收嗅覺刺激的功能，在通入CO2水中的化學平衡發(fā)生改變，免疫圖片實驗中發(fā)現(xiàn)通入CO2后會引起端腦區(qū)域的蛋白發(fā)生變化，即通入CO2后青鳉魚的嗅覺能夠感受到海水酸堿平衡發(fā)生了變化，從而使得在端腦區(qū)域有c-fos蛋白的表達；視葉位于間腦后方，是魚類的視覺中樞，并綜合各部分感覺的高級中樞，具有維持魚體平衡、協(xié)調(diào)和節(jié)制肌肉張力等作用，影響魚類游泳速度。通入CO2

6、后，觀察視頂蓋中c-fos蛋白的生成部位和含量變化。發(fā)現(xiàn)通入CO2后在視頂蓋邊緣位置的c-fos蛋白含量比對照組中多，這與現(xiàn)代研究海洋中溶解過多的CO2后降低幼魚的趨光性的研究相吻合；延腦位于腦的最后部，背面覆蓋后脈絡(luò)叢，其下方為第四腦室，腦室與脊髓內(nèi)的中央管相同。延腦前部兩側(cè)有耳狀突，為聽囊和側(cè)線的感覺中樞。延腦是多種生理機能以及感覺和呼吸的中樞，還是調(diào)節(jié)色素細胞作用的中樞。通入CO2后觀察到延腦中央有較多的c-fos蛋白表達，較對照

7、組有明顯的不同。延腦中出現(xiàn)較多的c-fos蛋白，即青鳉魚的多種生理機能、感覺或者呼吸中樞等多種活動受到了CO2的影響。本實驗中主要是通過觀察CO2對海洋青鳉魚受精的過程研究，觀察到受精卵的受精率確實降低，故而推測CO2可能影響了青鳉魚的產(chǎn)卵和受精的活動，造成受精率發(fā)生改變。
　　在青鳉魚卵發(fā)育過程中通入CO2，統(tǒng)計海洋青鳉魚卵的出膜率，發(fā)現(xiàn)海洋青鳉魚卵的出膜率和孵化時間以及性別比例都會受到酸化的影響，從出膜率的表格中我們能夠得到爆

8、CO2濃度為1000ppm時，生存水環(huán)境中CO2濃度出現(xiàn)線性趨勢，受精率在1000ppm時要比現(xiàn)階段空氣中CO2濃度的受精率要低，但是比通CO2濃度為2000ppm時也要低。同時，在通CO2濃度為1000ppm時，出膜率卻遠遠高于對照組，待其濃度繼續(xù)增加時，其出膜率反而降低。從而推測：低濃度CO2很可能是作為一種外界刺激，致使孵化中的幼魚對這個水環(huán)境的刺激發(fā)生了應(yīng)激反應(yīng)；而應(yīng)激反應(yīng)促進了青鳉魚卵孵化出膜速度上升，并且縮短了孵化時間。但是

9、外界環(huán)境CO2濃度過高時，對孵化中的幼魚會是一種危害的信號，致使幼魚開始自我保護躲避外界的危險信號，延長孵化時間。但是當幼魚長時間在魚卵膜內(nèi)不出膜，往往卵黃中的營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡之后仍未出膜，造成由孵化時間過長而出現(xiàn)的死卵情況。
　　將經(jīng)不同CO2濃度處理的青鳉幼魚飼養(yǎng)至性成熟后，與未經(jīng)酸化處理的對照組統(tǒng)計比較其性別比例。通過形態(tài)學和分子學水平觀察其第二性征和基因性別,發(fā)現(xiàn):
　　1）在體視顯微鏡下觀察，雄性臀鰭要比雌性臀鰭大

10、，背鰭也是雄性相對雌性大。雌性親魚的肛乳頭要明顯大于雄性，并且雌雄肛乳頭外周包裹著一層脂肪層，而雄性個體肛乳頭外周并未有脂肪層包裹。
　　2）通過分子水平基因檢測出：當CO2濃度為1000ppm時，同一批次魚卵受精產(chǎn)生的個體中有較多的雄性個體，并且有基因型為XX的雌魚會發(fā)生性逆轉(zhuǎn)表現(xiàn)型為雄性的個體，此時逆轉(zhuǎn)率為37%左右；當CO2濃度上升為2000ppm時，有接近47%的性逆轉(zhuǎn)率，此時同一個批次中青鳉魚有更多的雄性個體。