2014-免疫學檢驗與臨床應用

1、免疫學檢測原理及臨床應用,郭 繼 強,新鄉(xiāng)醫(yī)學院免疫學教研室,免疫學檢驗是應用免疫學理論設(shè)計的一系列測定抗原、抗體、免疫細胞及其分泌的細胞因子的實驗手段及分子生物學技術(shù)，在疾病的診斷、療效評價中應用廣泛。,細胞水平檢測,第一節(jié) 免疫學檢驗原理,基因水平檢測,分子水平檢測,一、免疫細胞的檢測,對機體參與免疫應答細胞進行分離、純化、鑒定、計數(shù)及功能測定。,外周血單個核細胞的分離（Peripheral blood mononuclear ce

2、ll,PBMC) T細胞和B細胞的分離 DC、NK、Mφ的分離,密度梯度離心(Ficoll)離心,（泛影酸葡甲胺-聚蔗糖）,E花環(huán)沉降法 ：分離T細胞（CD2-綿羊紅細胞）尼龍毛柱分離法 ：分離T或B細胞（B細胞尼龍毛的粘附力）。貼壁法：分離Mφ,利用細胞的吸附特性,利用細胞表面標志,T細胞：CD3，CD4，CD8,B細胞：CD79，CD19，CD5,NK：CD56+、CDl6,DC：CD11c，CD86,Mφ：CD11b，CD

3、86，CD83,親和版結(jié)合分離法,流式細胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）,采用激光作為激發(fā)光源；利用熒光染料與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合的標記技術(shù)；用計算機系統(tǒng)對流動的單細胞懸液中單個細胞的多個參數(shù)信號進行數(shù)據(jù)處理分析。,流式細胞儀工作原理,細胞1,細胞2,,Ag1,Ag2,,,流式細胞儀常檢測的細胞特性,,,流式細胞術(shù)技術(shù)分析,免疫磁珠分離immunomagnetic beads,磁珠抗體,免疫磁珠分離的正選法和負選

4、法,抗原肽-MHC四聚體分離技術(shù),,親和素,抗原肽,MHC I,生物素,熒光素,淋巴細胞的功能檢測,淋巴細胞功能測定可分為體內(nèi)實驗和體外實驗。體內(nèi)實驗主要是間接了解淋巴細胞對抗原、半抗原或有絲分裂原的應答反應；體外實驗主要包括淋巴細胞對抗原或有絲分裂原刺激后的增殖反應、細胞毒性試驗及淋巴細胞分泌產(chǎn)物的測定,T淋巴細胞增殖試驗,1. 原理：,淋巴細胞,,DNA合成,分化,,,,母細胞,刺激物,,,,,,,,,細胞變大,細胞漿擴大,空泡,核

5、仁明顯,核染色質(zhì)疏松,淋巴細胞轉(zhuǎn)化的刺激物,非特異性刺激物： PHA ------T細胞 ConA -------T細胞 PWM -------T、 B細胞 LPS -------B細胞特異性刺激物： 異種抗原 同種組織抗原,形態(tài)學檢查法,2. 方法：

6、,細胞漿，增大，可見空泡；細胞核增大，偏一側(cè)，核松散，可見核仁。,核仁,3H-TdR摻入法,T細胞殺傷功能測定,細胞毒試驗51Cr(鉻)釋放法,CTL,+,,MTT實驗 MTT全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，商品名：噻唑藍。是一種黃顏色的染料。 MTT比色法是一種檢測細胞存活和生長的方法。原理為活細胞線粒體中的琥珀

7、酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲臜(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比,MTT增殖實驗,MTT增殖實驗結(jié)果,吸光度,細胞數(shù),體內(nèi)試驗,特異性抗原皮膚試驗抗原：結(jié)核菌素（OT）植物血凝素（PHA）,二、B細胞功能檢測,B細胞增殖能力的

8、試驗溶血空斑試驗B細胞抗體形成功能的檢測體內(nèi)試驗,,,,(一)B細胞增殖能力的試驗,細菌脂多糖,,,B細胞增殖,,形態(tài)學,3H－TdR摻入法,,(二) 溶血空斑試驗,1. 原理：,,脾臟,綿羊紅細胞,綿羊紅細胞,3．臨床應用與評價,溶血空斑試驗主要用于測定藥物和手術(shù)等因素對體液免疫功能的影響評價免疫治療或免疫重建后機體產(chǎn)生抗體的能力。,酶聯(lián)免疫斑點Enzyme Linked ImmunoSPOT,1.ELISPOT技術(shù)起源與

9、發(fā)展,1983年, Czerkinsky&Sedgwick ：計數(shù)分泌抗體的 B 細胞；1985年，More：NC板，改進顯色底物，不再需要瓊脂糖凝膠;1988年，Czerkinsky et.al.: 首次將應用擴展到細胞因子檢測領(lǐng)域，T cell IFN-γ; 同年業(yè)發(fā)展出雙色標記技術(shù)；1995年，Schielen et.al.: 首次將PVDF膜板引入ELISPOT1997年，Gui et.al.：發(fā)展出計算機輔助的

10、斑點技術(shù)技術(shù)。,用抗體捕獲培養(yǎng)中的細胞分泌的細胞因子（或B細胞分泌的抗體），并以斑點顯色的方式將其表現(xiàn)出來。,3.ELISPOT技術(shù)原理,1.包被抗體 4℃ 過夜，洗滌；2.封閉37 ℃ 1h；3.加入淋巴細胞和刺激原37 ℃孵育8-40h；4.冰水裂解并移出細胞，洗滌；5.加入生物素標記的檢測抗體37 ℃ 1h，洗滌；6.加入酶聯(lián)親和素37 ℃ 1h，洗滌；7.加入顯色底物，顯色10~40min；8.獲得斑點，計數(shù)。,E

11、LISPOT一般操作流程,Elispot實驗結(jié)果（透明板）,Elispot實驗結(jié)果（PVDF板）,細胞吞噬功能測定,硝基藍四氮唑(NBT)試驗,吞噬細胞殺菌過程中產(chǎn)生反應性氧中間物，其中超氧陰離子能使被吞噬進細胞內(nèi)的NBT還原成不溶性藍黑色甲臜顆粒，沉積于胞漿中。光鏡下計數(shù)NBT陽性細胞可反映PMN的殺傷功能。,巨噬細胞吞噬試驗,將待測Mφ與雞紅細胞混合溫育后，雞紅細胞被Mφ吞噬，根據(jù)吞噬百分率確定mf吞噬能力。,吞噬百分率=吞有紅細

12、胞的Mφ/Mφ總數(shù),1.反映機體免疫功能狀態(tài)。2.腫瘤、免疫缺陷病等疾病的診斷和疾病預后監(jiān)測。3.組織器官移植后對受者的細胞免疫學功能監(jiān)測則有利于排斥反應的早期發(fā)現(xiàn)，以便及時采取有效措施。4.單克隆抗體和細胞因子的生產(chǎn)。,免疫細胞功能檢測的臨床應用,免疫標記技術(shù),免疫熒光技術(shù) 放射免疫分析法 酶免疫技術(shù) 發(fā)光免疫測定,免疫酶測定法,夾心法ELISA間接ELISABAS—ELISA 利用生物素和抗生物素蛋白為橋

13、梁,免疫組化技術(shù),定位、定性、定量檢測,結(jié)腸癌CEA抗原染色,放射免疫測定法(RIA)示意圖,形態(tài)學檢測普通光學顯微鏡檢測熒光顯微鏡檢測 材料：①石蠟切片; ②冰凍切片; ③細胞涂片,細胞凋亡的檢測,方法:電鏡觀察凋亡小體生化學方法免疫學方法末端標記法,形態(tài)學方法： ① PI染液：碘化丙啶(propidium iodide,PI)；核紅色 ② DAPI染液；核藍色 ③ AO染液（

14、吖啶橙）：核黃綠色* 凋亡細胞呈現(xiàn)核濃縮, 染色加深,凋亡小體。,凋亡的形態(tài)學檢測,U937 Cell（DAP1染色）,大鼠結(jié)腸組織,DNA的斷裂,細胞的皺縮,在細胞凋亡的早期就有細胞膜表面破損發(fā)生。破損時凋亡細胞表面的磷脂腺絲氨酸(PS)可以從細胞內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)至細胞的外膜。該過程發(fā)生在DNA片段化之前，因而檢測PS的表達，能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，對PS有很高的親和性，并且可以與暴露于細胞外的PS相

15、結(jié)合。PI的膜通透性很差，因而只能標記壞死的細胞。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(P1)來區(qū)分凋亡和壞死細胞。,熒光顯微鏡觀察細胞凋亡,流式檢測細胞凋亡,生化學方法電泳法 DNA Ladder電泳圖譜,核小體,凋亡細胞由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活, 核DNA被切割成許多雙鏈DNA片段以及高分子量DNA單鏈斷裂點(缺口), 暴露出大量3-羥基末端, 如用(TdT)將標記的-dUTP進行缺口末端標記, 則可原位特異地顯示出凋亡

16、細胞。 (一)熒光標記法 (二)酶標記法,原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù) (TdT或TUNEL),TUNEL染色原理,U937細胞（熒光素染色）,臨床意義--IgG 增高,多克隆性增高 見于各種慢性感染、慢性肝病、淋巴瘤、肺結(jié)核、鏈球菌感染以及自身免疫性疾病 單克隆性增高 僅見一種Ig增高，主要見于免疫增殖性疾病，如IgG分泌型多發(fā)性骨髓瘤,見于各種先天性和獲得性免疫缺陷病、聯(lián)合免疫缺陷病、也見于重鏈病、輕鏈病、腎病綜合癥、病

17、毒感染和免疫抑制劑患者,臨床意義--IgG 降低,IgA增高 見于IgA型MM（多發(fā)性骨髓瘤），SLE,類風濕性關(guān)節(jié)炎，肝硬化，濕疹和腎臟疾病等 IgA降低 見于反復呼吸道感染，原發(fā)和繼發(fā)性免疫缺陷病和自身免疫性疾病,臨床意義--IgA,(1)增高：常見于一些急性時相反應，如急性炎癥、傳染病早期、排異反應、急性組織損傷。 (2)減低：見于系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風濕性關(guān)節(jié)炎活動期、大多數(shù)腎小球腎炎(如鏈球菌感染后腎小球

18、炎、狼瘡性腎炎、基底膜增殖性腎小球腎炎)、慢性活動性肝炎、慢性肝病、肝硬化、肝壞死、先天性補體缺乏(如遺傳性C3缺乏癥)等。它們或是由于消耗或丟失過多或是由于合成能力降低造成。,臨床意義—補體C3,CD3 + CD4+減低 惡性腫瘤、遺傳性免疫缺陷、艾滋病、免疫抑制劑使用CD3+CD8+減低 自身免疫性疾病、變態(tài)反應性疾病Th/ Ts 比值增高：自免、病毒感染、變態(tài)反應減低：艾滋?。ㄐ∮?.5），惡性腫瘤進行期和復發(fā)時,