鄭州大學(xué)藥物分析第七章色譜法

1、第七章 色譜法,色譜法：利用物理或化學(xué)的方法將混合物組分分開(kāi)然后進(jìn)行鑒別和定量的方法,原理:相對(duì)運(yùn)動(dòng)的兩相 利用混合物中各組分與兩相親和力不同而分開(kāi)。,［用途］：用作藥物的鑒別、含量測(cè)定、雜質(zhì)檢查等方面［特點(diǎn)］：高靈敏度，高選擇性 高效率、應(yīng)用范圍廣,流動(dòng)相,固定相,,,［分類(lèi)］：根據(jù)操作條件的不同分類(lèi),柱色譜法紙色譜法薄層譜法氣相色譜法高效液相色譜法,,第一節(jié) 柱色譜,一、柱色譜

2、的組成及分離原理 1、組成：玻璃管：高徑比20~30：1 固定相：Al2O3 或硅膠（sio2XH2O ） 流動(dòng)相：各種極性的有機(jī)溶劑（洗脫劑） 2、分離原理：,混合物,色譜柱,分別收集,A(極性大)B(極性中)C(極性小),,,,,洗脫劑,,,影響分離因素： （1）各組分極性 （2） 洗脫劑極性 （3）吸附劑的活性,,A

3、(最后出柱)B(第二出柱)C(首先出柱),顯色熒光分段,,3、吸附劑和洗脫劑的選擇 （1）    吸附劑,堿性：PH=9~10用于烷烴、胺、生物堿氧化鋁 中性：PH=7.5 用于醛、酮、醌、酯 色譜專(zhuān)用 粘度：100-150目 酸性：PH=4-4.5 用于有機(jī)酸的分離,（2）溶劑和洗脫劑 溶劑的要求：①不與吸附劑起化學(xué)反應(yīng)

4、 ② 極性小，用量體積小可溶解樣品。 洗脫劑：極性適中使各組分分開(kāi) 極性：石油醚（烷烴）＞苯＞乙醚＞氯仿＞丙酮＞醇＞水＞酸，必要時(shí)采用混合溶劑或梯度洗脫。,,,二、實(shí)驗(yàn)步驟：,1、裝柱,干法,濕法,（1）柱均勻不能有氣泡裂縫（2）上層蓋脫脂棉、濾紙（3）上端保持一段溶劑（4）吸附劑高度為,混合物,,,,注意事項(xiàng),2、加樣及洗脫,分段收集洗脫液,純品,注意事項(xiàng)：（1）連續(xù)加入吸脫劑

5、防止干涸； （2）采用等分收集洗脫液； （3）控制洗脫劑流出速度,色譜分離過(guò)程,三、應(yīng)用實(shí)例：1、維生素K1注射液的含量測(cè)定（Ch.P2000） 維生素K1用植物油配成油溶性注射液，都有紫外吸收，采用柱分離。,維生素K,植物油,其它,戊烷,,,提取,V K1,植物油,,,中性A1203色譜柱,,乙醚戊烷(1:49),,洗脫lml/min,收集洗脫液

6、,紫外吸收,計(jì)算含量(入249處 =420),,2、阿斯匹林制劑中ASP含量，測(cè)定及水楊酸雜質(zhì)檢查（USP.23）采用柱色譜紫外分光度法。,第二節(jié) 薄層色譜,一、薄層色譜的構(gòu)成及原理1、組成：（1）玻璃板：5×10cm等（2）吸附劑： A1203 或硅膠,極性強(qiáng)的展開(kāi)劑與吸附劑作用強(qiáng)其洗脫力強(qiáng) 極性弱的展開(kāi)劑與吸附劑作用弱其洗脫力弱（4） 層析缸 應(yīng)密閉用蒸汽

7、飽和,薄層色譜,2、分離原理,（1）將A、B兩種混合物點(diǎn)樣在薄層板的一端，在密閉層析缸中用流動(dòng)相（展開(kāi)劑）展開(kāi)，A、B不斷地被吸附劑吸附，又被展開(kāi)劑溶解，由于A、B結(jié)構(gòu)不同，與吸附劑作用大小不同，因此A、B遷移速度不同，因此A與B分開(kāi)。,紙層析,（2）比移值(Rf)組分的遷移距離與展開(kāi)劑的遷移距離之比稱(chēng)為比移值(Rf),Rf 的最佳范圍0.3-0.5,Rf的可用范圍 0.2-0.8,條件一定情況下Rf為常數(shù),,Rf是定性

8、的依據(jù),對(duì)比文獻(xiàn)手冊(cè)法,對(duì)照品法,［討論］： （1）組分極性強(qiáng)Rf？ （2）吸附劑吸附強(qiáng)（級(jí)別可選擇）Rf？ （3）展開(kāi)劑的性質(zhì)：展開(kāi)劑極性強(qiáng)Rf？結(jié)論：為了使Rf符合要求 應(yīng)兼顧組分極性，吸附劑活性、展開(kāi)劑極性。,,（3）分離度：兩相鄰斑點(diǎn)的中心距離與兩斑點(diǎn)平均寬度的比值又稱(chēng)分離度（分辨率）,R=,,d、兩點(diǎn)中心距離W1、斑點(diǎn)1的寬度W2、斑點(diǎn)2的寬度,R＞1．5時(shí)符合要求，可完全分離,

9、（4）定量方法：①挖掉斑點(diǎn) → 溶劑萃取 → 過(guò)濾 → 蒸發(fā)溶劑 → 稱(chēng)量②薄層掃描儀：自動(dòng)計(jì)算斑點(diǎn)面積：與已知量的對(duì)照品對(duì)照,Ax — 待測(cè)組分斑面積As — 對(duì)照品斑點(diǎn)面積Mx — 待測(cè)組分的量Ms — 對(duì)照組分的量,=,二、實(shí)驗(yàn)步驟 1、薄層板的制備（5×20cm，10×20cm）,硅膠G,糊狀,均勻鋪層,室溫干燥,活化,干燥保存,氧化鋁G,,,,水,,,加熱110℃,30min,糊狀,均勻

10、鋪層,室溫干燥,,,水,,,加熱,,,,三級(jí)板,二級(jí)板,2、點(diǎn)樣與展開(kāi),點(diǎn)樣,點(diǎn)樣線距離部2.0cm點(diǎn)間距離1.5-2.0cm點(diǎn)大小2-4mm,展開(kāi),展開(kāi)劑飽和展開(kāi)缸展開(kāi)劑深度0.5-1.0cm(不能浸沒(méi)樣點(diǎn))密封展開(kāi)劑的規(guī)定距離(10-15cm)取出板子，標(biāo)好前沿，晾干,,,3、斑點(diǎn)定位,（1）組分有顏色 直接定位,（2）顯色劑顯色,通用顯色劑,I2蒸汽,硫酸,(噴霧法),專(zhuān)用顯色劑(如茚三酮使氨基酸顯色),（3）無(wú)合適顯

11、色劑 熒光板 定位,三、應(yīng)用 1、作為柱色譜的先導(dǎo)試驗(yàn)，進(jìn)行模擬和條件優(yōu)化 （吸附劑、洗脫劑、溶劑） 2、藥物的鑒別 3、藥物的雜質(zhì)檢查 4、藥物含量測(cè)定：,,,第三節(jié) 氣相色譜法,一、概述1、氣相色譜：以氣相為流動(dòng)相的色譜,2、分類(lèi)：固定相,載體+固定液（高沸點(diǎn)液體）,分配型,重點(diǎn)：氣-液色譜,3、分離原理：,4、應(yīng)用特點(diǎn)： （1）高

12、靈敏度 （2）高選擇性 （3）高效能 （4）分析速度快（5）自動(dòng)化程度高,5、應(yīng)用范圍：分析對(duì)熱穩(wěn)定，具有一定揮發(fā)性的樣品，,二、氣相色譜儀的組成,1、構(gòu)成,2、操作流程：①調(diào)載氣流速②調(diào)節(jié)柱溫等③進(jìn)樣④檢測(cè)⑤電信號(hào)放大⑥記錄,檢測(cè)器、熱導(dǎo)池檢測(cè)器、氫火焰離子化檢測(cè)器。,色譜柱：U型或螺旋型 金屬管、 固定液、載體（擔(dān)體）組成。,二、氣相色譜圖,進(jìn)樣,,,,,,,,,,,,tR,,,,h

13、,,,,,0.5h,Wh/2,,,,,,W,t,1、主要參數(shù)：（1）基線：沒(méi)有樣品進(jìn)入檢測(cè)器時(shí)，噪音隨時(shí)間的變化。,（2）保留時(shí)間tR：從進(jìn)樣到組分色譜峰頂點(diǎn)的時(shí)間（3）峰高h(yuǎn)/峰面積：從最高點(diǎn)到基線的距離。（定量）（4）峰寬W：拐點(diǎn)作切線在基線上的載距。W越窄柱效高。（5）半峰寬Wh/2點(diǎn)：峰高一半處的峰寬。,（6）理論塔板數(shù)。 n=5.54(tR/wh/2)2 一般n>103 n越大柱效高,（7）分

14、離度： 當(dāng)R＞1.5時(shí)認(rèn)為分離完全。,三、色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)方法1、理論塔板數(shù)：（1）計(jì)算：n=5.54(tR/Wh/2)2（2）規(guī)定：所測(cè)理論塔板數(shù)度不低于藥典中該品種規(guī)定。（3）改善方法：改變柱長(zhǎng)，改變固定相、柱填充均勻、柱溫等。2、分離度：,規(guī)定R＞1.5或按藥典規(guī)定。,色譜流出曲線,3、重復(fù)性取對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣五次，其峰面積RSD≤2%，為合格。4、拖尾因子,W0.05：峰高0.05

15、處峰寬d1： 峰極大到峰前沿的距離規(guī)定：T應(yīng)在 0.95~1.05之間,四、氣相色譜的應(yīng)用1、在鑒別中的應(yīng)用：（利用保留值）,定性方法,在規(guī)定條件下測(cè)tR與文獻(xiàn)對(duì)照,把對(duì)照品和待測(cè)物分別做色譜，對(duì)比tR,加入已知對(duì)照品于混合待測(cè)物中，若某組分峰顯著增加即為該組分,,2、定量方法,含量測(cè)定,雜質(zhì)檢查,外標(biāo)法,內(nèi)標(biāo)法,,,,,,,第四節(jié) 高效液相色譜法（HPLC）,HPLC優(yōu)點(diǎn)：（1）應(yīng)用范圍廣；（2）柱效高；

16、 （3）分離效率高,一、高效液相色譜儀器構(gòu)成1、高壓泵：輸送流動(dòng)相，流量恒定，無(wú)脈沖±2%壓力150-500atm。2、色譜柱：柱管內(nèi)徑2-5mm，長(zhǎng)10-30cm。3、進(jìn)樣閥：六通進(jìn)樣閥4、檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器 （濃度信號(hào)---光---電信號(hào)）,二、高效液相色譜片的分類(lèi)（1）正相色譜法：固定相：氰基鍵合硅膠，氨基鍵合硅膠 極性大流動(dòng)相：極性較小的有機(jī)溶劑，如：正已烷用途

17、：分離強(qiáng)極性化合物例如：酚磺乙胺的含量測(cè)定,（2）反相色譜法： 固定相：C18和C8柱 極性小 流動(dòng)相：甲醇—水，乙腈—水 用途：分離非極性 中強(qiáng)極性化合物 舉例：苯海拉明片含量測(cè)定，C18柱，甲醇—乙胺流 動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)225nm,,,,,,,,SOSH,HO,OH,HN(C2H5)2,O,,(3)反相離子對(duì)色譜：在流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑，使待測(cè)離子形成中性離子對(duì),+4,用途：分離在溶液

18、中為形成離子的化合物，如：生物堿、胺類(lèi)舉例：對(duì)氨基水楊酸鈉中，間氯基酚的檢查C18柱，甲醇—磷酸四丁基銨為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。,三、高效液相色譜的應(yīng)用1、鑒別：在相同條件下，對(duì)比供試品溶液和對(duì)照品的保留時(shí)間。2、含量測(cè)定：內(nèi)標(biāo)法：內(nèi)標(biāo)物與供試品混合后進(jìn)樣，比較峰面積外標(biāo)法：選對(duì)照品與供試品分別進(jìn)樣，比較峰面積3、雜質(zhì)檢查：（采用五種定量方法）（1）外標(biāo)法；（2）內(nèi)標(biāo)法；（3）面積歸一化法； (4)主成份自身對(duì)

19、照法; (5)加校正因子主成份自身對(duì)照法。,吸附劑活性級(jí)別 氧化鋁含水量(%) 0 3 6 10 15  硅膠含水量(%) 0 5 15 25 38  活性及級(jí)別 　　 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅲ Ⅴ注：一般選用II、III活性級(jí)別的吸附劑,,,,,氧化鋁板,氧化鋁G 氧化鋁H氧化鋁HF254氧化鋁GF2

20、54,硅膠 (Sio2·XH2O),硅膠H硅膠G硅膠60G硅膠HF254硅膠GF254,,,,,,,,,,,,,,,,2cm,1.5cm,,,,,,例1：頭孢拉定、頭孢氨芐等頭孢類(lèi)的鑒別硅膠G薄層板展開(kāi)劑：0.1m枸櫞酸/0.2M磷酸氫二鈉/丙酮(60：40：1.5)顯色劑：0.1%的茚三酮溶液規(guī) 定：供試品主斑點(diǎn)應(yīng)與對(duì)主斑點(diǎn)一致 樣品 對(duì)照品

21、,,,,,,,,,,例2：硫酸慶大霉素的鑒別(Chp2000.BP2000)硅膠G薄層板（ 105℃活化2hr）展開(kāi)劑：氯仿/甲醇/氨（1：1：1）顯色劑：I2蒸氣規(guī) 定：供試品主斑點(diǎn)應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)品溶液所顯 斑點(diǎn)一致。,,例：甾體激素藥物中雜質(zhì)“其它甾體的檢查”（供試品3mg/ml）薄層板：硅膠G或硅膠GF254或硅膠HF254展開(kāi)劑：二氯乙烷—甲醇—水溶 劑：氯仿顯色劑：堿性四氮唑藍(lán)或20%.HF

22、04規(guī) 定：供試品雜質(zhì)斑點(diǎn)不得多于2個(gè)， 其顏色與對(duì)照液（60mg/ml）相比， 不得更深。,,例：六味地黃丸中、山朱萸的含量測(cè)定薄層板：硅膠G板展開(kāi)劑：環(huán)已烷/氯仿/醋酸乙酯/甲酸 (20:5:8:0.1)溶 劑：乙醇顯色劑：10%.H2SO4溶液測(cè)定法：薄層掃描、波長(zhǎng)λS=520nm

23、 λR=700nml測(cè)定供試品與對(duì)照品吸收度積分值規(guī) 定：水蜜丸每1g不能少于0.2mg,,被測(cè)樣品在和固定液的接觸過(guò)程中，發(fā)生多次溶解—揮發(fā)過(guò)程，不同組分，在固定液中溶解不同，因此出柱的時(shí)間不一，各組分彼此分開(kāi)。,載氣,,,,,,,,,A+B,A,B,A,B,檢測(cè) 器,,,,,,,A,B,,,,,常見(jiàn)固定液,非極性： 角鯊?fù)?、阿匹?分離烴等非極性物質(zhì),弱中極性

24、：甲基硅油、苯基硅氧烷,中強(qiáng)極性：鄰苯二甲酸酯，聚乙二醇,,（squalane）,（Apiezon）,（SE-30）,分離醇、酸、酮、酯、胺等,低苯基 SE-52中苯基 OV-17高苯基 OV-25,,,分離中極性有機(jī)物,（PEG-300）,,載體種類(lèi),硅藻土型,非硅藻土型：聚四氟乙烯，有腐蝕性化合物,,（701、702）,（分離極性物質(zhì)）,紅色擔(dān)體：,（201、202）,（分離弱極性、非極性物）,,,白色擔(dān)體,1、熱導(dǎo)池檢測(cè)

25、器（TCD）—通用檢測(cè)器,參比臂（通入載氣）測(cè)量臂（通入來(lái)自色譜柱氣）特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、測(cè)量范圍廣、 熱穩(wěn)定性好線性范圍寬、 樣品不被破壞缺點(diǎn)：靈敏度低.靈敏度He＞H2＞N2,,2、氮火焰離子化檢測(cè)器（FID）—有機(jī)碳專(zhuān)用檢測(cè)器,燃?xì)?,,H2,O2（空氣）,,,高溫,有機(jī)物,電離,離子室,CH3…CH2 CH3,,nCH3+ne,收集極,發(fā)射極,,,,ISOV直流電壓,,正負(fù)離子向

26、電極移動(dòng),產(chǎn)生電流，經(jīng)放大記錄，信號(hào)大小與進(jìn)入火焰的碳原子數(shù)有關(guān)特點(diǎn)：靈敏度高，線性范圍廣，專(zhuān)屬性檢測(cè)器，樣品破壞。,,（1）外標(biāo)法：,待測(cè)物 稱(chēng)量 配成溶液 注入儀器 色譜圖 AX,,,,,精密,對(duì)照品 稱(chēng)量 配成溶液(CR) 注入儀器 色譜圖 AR,,,,,例：苯甲醇中苯甲醛的檢查 《中國(guó)藥典》2000版,色譜條件：載體：102白色擔(dān)體（60-80目）

27、 固定液： 聚乙二醇20M為固定液（W/W：10%） 載色：N2，15ml/min 色譜柱：不銹鋼φ3mm×4m 柱溫：130℃ 氣化溫度：180 ℃ 檢測(cè)器：氫火焰離子化,供試品 10μl 注入儀器

28、 氣相色譜圖（面積：0.8）,,,,苯甲醛 50mg 25ml 注入儀器,,,,,精密稱(chēng)定,對(duì)照品,水溶解,取10μl,氣相色譜圖（面積：10）,（藥典規(guī)定：含甲醛量不得超過(guò)0.2%）,計(jì)算：,＜0.2%合格,,（2）內(nèi)標(biāo)法：,結(jié)構(gòu)相似，待測(cè)樣品中沒(méi)有的組分。出峰與待測(cè)組分相鄰近，但能分開(kāi)（R＞1.5）純度合乎要求的純物質(zhì),內(nèi)標(biāo)要求：,AR

29、：待測(cè)物對(duì)照品峰面積 AS：內(nèi)標(biāo)峰面積CR：待測(cè)物對(duì)照品濃度 CS：內(nèi)標(biāo)濃度,CS=K1ASCR=K1AR,,f—校正因子,第一步：先用待測(cè)物對(duì)照品（已知CR）和內(nèi)標(biāo)（已知CS）混樣進(jìn)入儀器，求出,第二步：再用待測(cè)物（未知CX）和內(nèi)標(biāo)（已知CS）混樣進(jìn)入儀器代入上公式：,∴,CS 已知，f：已求出,AS Ax測(cè)出,,例：VE的含量測(cè)定《中國(guó)藥典》95版，USP(23)方法

30、,(1)色譜條件：（系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)）,載氣：N2 固定相OV-17 硅藻土（60-80） （W/W：2%） （內(nèi)標(biāo)十六酸十六醇酯）,柱溫：265℃ 檢測(cè)器：氫火焰離子化檢測(cè)器，與 內(nèi)標(biāo)分離度＞2，理論塔板數(shù)＞1000,（2）校正因子測(cè)定：,（取內(nèi)標(biāo),,正已烷,溶解,釋稀,（1.0mg/ml）精密量取,10ml,對(duì)照品維生素E,,20mg,,正已烷,精密量取

31、,10ml,,,,校正因子,（4）結(jié)果,含量%=,,（3）面積歸一化法雜質(zhì)峰占所有峰總面積中比例不超過(guò)一定數(shù)值來(lái)限量。例：《中國(guó)藥典》阿司帕坦中有關(guān)物質(zhì)的檢查：,樣品,流動(dòng)相,（6mg/ml）,溶液,取10μl,記錄圖譜,進(jìn)樣,,,,規(guī)定 雜質(zhì)峰面積總和/總峰面積≤20%合格,,,,,（4）主成份自身對(duì)照法無(wú)雜質(zhì)對(duì)照品，以供試品稀溶液為限量對(duì)照溶液，比較雜質(zhì)峰與對(duì)照液中的主峰面積，粗略計(jì)算雜質(zhì)的限量。例：《中國(guó)藥典》中吉非羅齊的

32、有關(guān)雜質(zhì)檢查：,供試品,流動(dòng)相,（10mg/ml）,待測(cè)液,對(duì)照液,色圖譜(1),進(jìn)樣,,,,規(guī)定 所有雜質(zhì)峰的面積和不得大于主峰的面積（注：主成份濃度約0.02%，雜質(zhì)不超過(guò)為合格）,,取5μl,,精密定量,,（0.2mg/ml）,,,待測(cè)液各雜質(zhì)峰分別乘上校正因子后與對(duì)照品主成份峰面積比較，分別計(jì)算各雜質(zhì)含量。a、建立方法時(shí)測(cè)各雜質(zhì)對(duì)照品與主藥對(duì)照品進(jìn)樣后的校正因子。,各雜質(zhì)校正因子按,分別計(jì)算,b、供試品溶液,主成份與雜