2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、現(xiàn)代生化儀器分析,電泳技術(shù),電泳的基本原理,電泳是在電場的作用下而產(chǎn)生的物質(zhì)運動,不同的物質(zhì)在一定的電場強度下,由于所帶電荷不同,因此受到的引力不同,向相反電極泳動速度不同進而達到分離目的。,在一定pH條件下,每一種分子都具有特定的電荷(種類和數(shù)量)、大小和形狀,在一定時間內(nèi)它們在相同電場中泳動速度不同,各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進行分離、分析和鑒定的基本原理。,電泳的分類,顯微電泳等電聚焦

2、電泳等速電泳密度梯度電泳,電泳,自由電泳(無支持體),區(qū)帶電泳(有支持體),,,,濾紙電泳(常壓及高壓)薄層電泳(薄膜及薄板)凝膠電泳(瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠),聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠具有機械強度好,有彈性,透明,化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,對pH和溫度變化小,沒有吸附和電滲作用小的特點,是一種很好的電泳支持介質(zhì)。,聚丙烯酰胺凝膠電泳按原

3、理和操作形式的不同,主要有不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳和雙向電泳等類型。,不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳,系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個方面:,凝膠由上、下兩層凝膠組成,兩層凝膠的孔徑不同,上層為大孔徑的濃縮膠,下層為小孔徑的分離膠。,緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同。電極緩沖液為pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液,濃縮膠為pH6.7的Tris-HCl緩沖液,而分離膠為pH8.9的Tris-HCl緩沖液。

4、,在電場中形成不連續(xù)的電位梯度。在這樣一個不連續(xù)的系統(tǒng)里,存在三種物理效應(yīng),即樣品的濃縮效應(yīng),凝膠的分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng),由于這三種物理效應(yīng),使樣品分離效果好,分辨率高。,瓊脂糖凝膠電泳,瓊脂糖凝膠電泳是分子生物學(xué)研究中常用的技術(shù),可用于分離,鑒定和純化DNA或RNA片段。不同大小、不同形狀和不同構(gòu)象的DNA分子在相同的電泳條件下,有不同的遷移率,所以可通過電泳使其分離。,分離不同大小DNA片段的合適瓊脂糖凝膠濃度,,在凝膠電泳中,一

5、般加入溴化乙錠(EB)--ethidium bromide染色,此時,核酸分子在紫外光下發(fā)出熒光,肉眼能看到約50ng DNA所形成的條帶。,電泳緩沖液,,TAE:乙酸鹽緩沖液TBE:硼酸鹽緩沖液TPE:磷酸鹽緩沖液,電泳裝置,,Structure and Function Analysis of Nucleocapsid Protein of Tomato Spotted Wilt Virus Interacting with R

6、NA Using Homology Modeling,,研究背景:,對于許多病毒的蛋白來說,很難得到它們的晶體結(jié)構(gòu),因此這就對分析病毒蛋白的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生了困難。這些病毒中就包括番茄斑萎病毒(TSWV),結(jié)果:,使用同源建模的方法,通過實驗分析論證,得出了病毒粒子的RNA與病毒核衣殼蛋白的結(jié)合位點,同時發(fā)現(xiàn)了TSWV的核衣殼蛋白可以保護RNA免遭RNA酶的分解這一特點。,結(jié)論:,同源建模為TSWV核衣殼蛋白的功能以及與RNA相互作用的分

7、析提供了基礎(chǔ)依據(jù)。,意義:,同源建模的方法也可應(yīng)用于其他植物病毒。,Abstract&Introduction:,TSWV病毒粒子的核糖核蛋白(RNP)中包裹的RNA為病毒基因的轉(zhuǎn)錄和基因組的復(fù)制提供了模板(而不是裸露的RNA),在核糖核蛋白包裹基因組RNA的過程中,TSWV的結(jié)構(gòu)蛋白核衣殼蛋白(N)發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。然而,很少有人知道該過程的分子機制,N與基因組RNA是如何相互作用的呢?在這項研究中,我們證實了TSWV的核

8、衣殼蛋白會形成一系列高度有序的低聚物。在對這些低聚物與基因組RNA的結(jié)合行為的分析中,揭示了這些低聚物與RNA的結(jié)合沒有特異性,各種類型的N低聚物都可與RNA結(jié)合。為了更好的確定與RNA作用的N蛋白的結(jié)構(gòu)和功能,我們采用同源建模的方法,構(gòu)建了N和N-RNA復(fù)合物的同源模型?;趯@些同源模型的分析,我們就可以預(yù)測出N蛋白的結(jié)構(gòu),同時發(fā)現(xiàn)在該結(jié)構(gòu)的表面存在大量的帶正電荷的極性氨基酸殘基,并且證實這些對N蛋白與RNA的結(jié)合是至關(guān)重要的另

9、外對得出的N-RNA復(fù)合物模擬結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),RNA牢牢嵌入了這個復(fù)合物中。因此,由于N-RNA復(fù)合物的形成可以使病毒的RNA抵抗RAN酶的消化,質(zhì)粒的構(gòu)建,在該實驗中共構(gòu)建了三種質(zhì)粒。第一種是表達野生型TSWV 核衣殼蛋白(N)的質(zhì)粒。使用的質(zhì)粒載體是pET 28a,該質(zhì)粒上帶有多聚組氨酸標(biāo)簽(His6 Tag),有利于后期蛋白的分離純化。第二種是表達突變型TSWV核衣殼蛋白(N)的質(zhì)粒。表達出來的突變型N是通過定點突變實現(xiàn)的。

10、這種蛋白為后面分析RNA的結(jié)合位點提供材料。第三種是克隆質(zhì)粒,轉(zhuǎn)錄的RNA用于探針的制備。使用的質(zhì)粒是pMD19,該質(zhì)粒帶有TSWV末端序列,并且?guī)в芯G色熒光蛋白標(biāo)記基因。,蛋白表達和純化,構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli(DE3)中進行表達,將10ml 過夜培養(yǎng)的大腸桿菌轉(zhuǎn)移到1L的容器中在37攝氏度下繼續(xù)培養(yǎng),直到600nm處的光密度值達到0.6為止。,加入0.1mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-

11、thiogalactopyranoside IPTG)誘導(dǎo)蛋白的表達。需要在25度下過夜培養(yǎng)。,溶菌酶處理培養(yǎng)液,然后在冰上用超聲波破碎培養(yǎng)液中的細胞,在12800 X g的離心力下離心1小時。,取上清液,采用NI-NTA親和層析法純化蛋白,,,,檢驗重組蛋白準(zhǔn)確表達,將純化得到的重組TSWV N蛋白進行SDS-PAGE,得到下圖結(jié)果。從圖中可以得出重組蛋白的分子量大約在25kDa---35kDa之間。然后再通過蛋白免疫印跡同樣檢測到

12、了重組蛋白。因此可以確定重組蛋白得到準(zhǔn)確表達。,重組TSWV N蛋白可以與E.coli 的胞內(nèi)RNA結(jié)合,當(dāng)紫外分光光度計測定純化的蛋白的濃度是發(fā)現(xiàn),純化的TSWV N蛋白的OD260/OD280的值上升到了1.7,這說明TSWV N蛋白結(jié)合了E.coli的內(nèi)源RNA。為了證明這一推論,我們將得到的純化的蛋白做變性處理,使其將結(jié)合的RNA釋放出來。同時,提取了在相同品系中表達的重組麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)作為對照。將兩種結(jié)合蛋白

13、變性處理后,加到經(jīng)過EB染色的1%的瓊脂糖凝膠上檢測RNA。觀察結(jié)果圖得出,在N 蛋白的區(qū)域很容易檢測到RNA,而MBP的區(qū)域沒有檢測到RNA存在。因此得出結(jié)論 :TSWV N蛋白可以與E.coli的內(nèi)源RNA非特異的結(jié)合。,TSWV N 蛋白可以形成不同形式的低聚物,為了證實N蛋白形成低聚物,我們進行了濃度不連續(xù)非變形的凝膠電泳(即BN-PAGE)。這種電泳使用的膠為非變性膠,可以使蛋白復(fù)合物在處于活性狀態(tài)下得到分離。將得到的

14、純化N 蛋白進行BN-PAGE。得到下圖結(jié)果。,從左側(cè)的電泳圖中可以看出,TSWV N蛋白形成了一系列的不同類型的低聚物。有31kDa的單體,62kDa的二聚體,93kDa的三聚體,124kDa的四聚體,155kDa的五聚體。,由于做電泳使用的蛋白是用Ni-NTA純化得到的蛋白,所以這些蛋白中帶有組氨酸標(biāo)簽。為了排除低聚物的形成是由于這些標(biāo)簽引起的這一可能。我們把帶有標(biāo)簽的蛋白的N末端的組氨酸標(biāo)簽切去得到不帶有標(biāo)簽的蛋白。對這些蛋白進行

15、相同的電泳分析,得到如下圖的結(jié)果。,觀察電泳圖發(fā)現(xiàn)形成的各類低聚物條帶與帶有標(biāo)簽蛋白的電泳條帶是一樣的。同樣形成了各種類型的低聚物。這就說明N蛋白可以通過自身的交聯(lián)形成各種類型的低聚物。,為了更進一步的證實以上的結(jié)論,我們在純化的蛋白中加入了交聯(lián)劑(戊二醛)。然后在5%-20%SDS-PAGE分離,并用考馬斯亮藍染色。從電泳圖中很明顯的可以發(fā)現(xiàn),隨著交聯(lián)劑的不斷增加,各個類型低聚物的條帶的顏色不斷加深。這就又證實了以上的結(jié)論:TSWV

16、N蛋白可以形成一系列的高度有序的低聚物。,TSWV N 蛋白的低聚物與RNA的結(jié)合,從以上的實驗中我們已經(jīng)確定N 蛋白形成了不同類型的低聚物,接下來研究這些低聚物與RNA分子的結(jié)合,與RNA的結(jié)合是否與低聚物的形成有一定的聯(lián)系。由于從E.Coli中表達出的重組N蛋白可以與E.Coli的RNA非特異結(jié)合,所以在研究N蛋白與TSWV的RNA的結(jié)合之前需要除去重組N蛋白上結(jié)合的E.Coli RNA。使用PEI(聚乙烯亞胺)處理得到的N蛋白,然

17、后分別對PEI處理的蛋白和未經(jīng)處理的蛋白進行RNA凝膠電泳分析。得到下圖結(jié)果:,很容易從圖中觀察到在未經(jīng)處理的N蛋白中檢測到了RNA,而經(jīng)過處理的蛋白中沒有RNA。所以經(jīng)過PEI的處理重組蛋白上結(jié)合的E.Coli RNA會被沉淀過濾掉。,接下來為了確定N 蛋白結(jié)合RNA是否是形成蛋白低聚物所必須的,我們將經(jīng)過PEI處理的蛋白和未經(jīng)PEI處理的蛋白分別進行BN-PAGE。得到了如下圖所示的電泳圖譜:,從圖中可以看出經(jīng)PEI處理和未經(jīng)處理

18、的蛋白產(chǎn)生了相似的條帶,都形成了一系列的低聚物。,結(jié)合上面的實驗證實N蛋白低聚物的形成與是否結(jié)合有RNA無關(guān),分析N蛋白與RNA的結(jié)合作用。將一定量的PEI處理過的N蛋白與未標(biāo)記的RNA(ssRNA,帶有TSWV末端序列)混合,并逐漸增加RNA的量,然后將混合物在不連續(xù)的非變性凝膠中電泳。同樣的樣品也進行了變性的SDS-PAGE。,ssRNA的量在1-10微克時,所形成的復(fù)合物的類型并沒有發(fā)生變化,但是當(dāng)繼續(xù)增加ssRNA的量在20-8

19、0微克時,發(fā)現(xiàn)各種類型的低聚物消失了。低聚物的消失說明了各個類型的低聚物結(jié)合了更多的ssRNA形成了更大的復(fù)合物。分析各個樣品的SDS-PAGE結(jié)果可以說明低聚物的消失不是由蛋白酶的降解造成的。,TSWV N蛋白可以結(jié)合E.Coli的內(nèi)源RNA,我們利用它這一特點來論證N蛋白形成的各個類型的低聚物都可以與RNA結(jié)合。,將從大腸桿菌中分離純化出來的N蛋白,在4%-16% 的藍色的非變性的凝膠中電泳分離,加RNA結(jié)合緩沖液(95%的甲酰胺)

20、使蛋白復(fù)合中的RNA釋放出來,100度沸水浴5分鐘,在1%瓊脂糖凝膠(含有EB)中電泳,紫外光下照射觀察,膠回收,破碎膠,加PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)洗脫,,,,從瓊脂糖電泳圖譜中可以看出,在1,2,3,4區(qū)域內(nèi)均檢測到了RNA,所以可以得出結(jié)論,TSWV N蛋白所形成的不同形式的低聚物均可與RNA結(jié)合。,構(gòu)建TSWV N 和N-RNA復(fù)合物的同源模型,先前的研究已經(jīng)證實,TSWV N的大約一半的氨基和羧基與RNA的結(jié)合有關(guān)。然而,由

21、于與RNA結(jié)合有關(guān)的那些帶正電的氨基酸殘基數(shù)量大,而且分布在整個N的肽鏈上,因此要確定N蛋白與RNA的結(jié)合位點是相當(dāng)有難度的。,為了克服這個難題,我們直接利用同源建模的方法,模擬出N蛋白以及N-RNA 復(fù)合物的3D結(jié)構(gòu),通過直接的觀測其結(jié)構(gòu)來確定到底是哪幾個氨基酸殘基在RNA的結(jié)合中起作用。然后再通過定點突變,進行反向驗證。突變由觀察得來的結(jié)合位點,看看N蛋白與RNA的結(jié)合能力是否發(fā)生改變,從而確定是否是該位點在結(jié)合中起作用,達到確定結(jié)

22、合位點的目的。,上圖便是通過I-TASSER程序模擬出來的TSWV-N的結(jié)構(gòu),從圖A中可以看出這個結(jié)構(gòu)由四部分組成,分別是N-末端臂,C-末端臂,N端結(jié)構(gòu)域,C端結(jié)構(gòu)域。圖B是圖A旋轉(zhuǎn)90度的效果圖。N端和C端的臂可能與蛋白低聚物的形成有關(guān)。N端和C端結(jié)構(gòu)域形成了N蛋白的核心結(jié)構(gòu)。N端和C端形成了一個裂縫可能與RNA的結(jié)合有關(guān),為了進一步驗證模擬的結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性,我們將與TSWV 病毒同科的其他布尼亞病毒的N結(jié)構(gòu)進行比對,將二者重疊,可以

23、發(fā)現(xiàn)兩者的結(jié)構(gòu)出C和N端的臂不同外,主要的核心結(jié)構(gòu)域非常相似而且重疊起來。這就證明了模擬結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性。,模擬一條有11個核苷酸的RNA鏈與N蛋白結(jié)合,得到E圖的N-RNA復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。和明顯看出,RNA鏈牢牢的嵌入核心結(jié)構(gòu)域形成的裂縫里,被兩側(cè)的蛋白包裹。對非結(jié)構(gòu)的表面電荷進行分析,得到F圖,在RNA與蛋白的結(jié)合的裂縫的區(qū)域存在大量的正電荷(藍色區(qū)域)。,確定TSWV N蛋白上的RNA結(jié)合位點,通過對TSWV N 蛋白的模擬結(jié)構(gòu)的分

24、析,可以推測N蛋白裂縫區(qū)域的表面正電荷與RNA的結(jié)合有關(guān)。為了確定N蛋白具體哪一個氨基酸殘基與RNA的結(jié)合相關(guān),我們從GenBank中調(diào)出20種番茄斑萎病毒N蛋白的氨基酸序列進行比對。通過比對發(fā)現(xiàn)一些帶正電和極性氨基酸都是保守序列,并且這些氨基酸殘基都位于裂縫的區(qū)域。,把這些保守的,帶正電的以及極性的氨基酸作為突變位點進行定點突變。將這些氨基酸突變成丙氨酸。選取十個突變位點進行丙氨酸替換。 R60A, K65A/K68A, K81A,

25、R94A/R95A, K183A/Y184A, and K192A/T195A。在E.Coli 中表達出所有的突變體蛋白,用PEI除去E.Coli的內(nèi)源RNA,然后用Ni-NAT純化。純化出的蛋白在藍色的4%-16%非變性膠中電泳,各種類型的低聚物得到分離。如下圖所示:,野生型的和突變型的蛋白形成了相似的條帶,說明通過突變對N蛋白低聚物的形成并未產(chǎn)生實質(zhì)的影響,為了確定各種突變的蛋白是否都對與RNA的結(jié)合能力產(chǎn)生了影響,我們分別測定了突

26、變蛋白RNA復(fù)合物的解離常數(shù)。首先從凝膠中回收各種突變蛋白,將蛋白與一定量的RNA探針混合(DIG標(biāo)記且包含TSWV末端序列),使二者結(jié)合形成復(fù)合物,采用濾膜結(jié)合法(Filter Binding assay)測定解離常數(shù)。結(jié)果如下圖所示:,從右側(cè)結(jié)果可以看出,R60A,K65A/K68A,K81A,K192A/T195A這幾個位點的突變的蛋白復(fù)合物的解離常數(shù)與野生型相差不大,說明這些突變并未影響蛋白與RNA的結(jié)合。而K183A/Y184

27、A,R94A/R95A的突變是解離常數(shù)明顯增大,也就是蛋白與RNA的親和力明顯減小。也說明蛋白與RNA的結(jié)合與這幾個位點有關(guān)。,為了進一步證實以上的結(jié)論,我們對以上的兩種突變體進行凝膠遷移分析(Electrophoretic mobility shift assay EMSA)。DIG標(biāo)記的RNA探針分別與野生型,R95A/R94A突變型,和K183A/Y184A突變型雜交,并且不斷增加蛋白的含量。然后分別在1%的瓊脂糖凝膠中電泳,然后

28、檢測DIG探針。得到下圖結(jié)果:,明顯可以看出突變的蛋白與RNA的結(jié)合能力顯著下降,因此Arg94, Arg95, Lys183, 和 Tyr184這些氨基酸殘基對蛋白與RNA的結(jié)合起著至關(guān)重要作用,在模擬結(jié)構(gòu)中顯示氨基酸位置發(fā)現(xiàn)這些氨基酸剛好位于蛋白表面的裂縫區(qū)域。,RNA結(jié)合TSWV N蛋白形成復(fù)合物后對RNA酶的抵抗作用分析,通過對N- RNA復(fù)合物的同源建模,我們從3D結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn),RNA鏈可以牢牢的嵌入到蛋白表面的裂縫中,并被蛋白

29、分子包裹。由此可以推測蛋白對RNA鏈的包裹,可以抵抗RNA酶對RNA的消化。接下來通過實驗進行論證。,首先將DIG標(biāo)記的RNA探針(代替RNA)10ng分別與野生型和突變型的N蛋白(2微克)室溫下混合10分鐘,使二者結(jié)合形成N-RNA復(fù)合物,然后加入RNA酶,并且使反應(yīng)體系處于37度,并逐漸增加酶的含量。同時不混合蛋白的RNA探針也被相同條件的酶處理,作為對照。,最后,將樣品加到1%的瓊脂糖凝膠中固定,用地高辛(DIG)免疫抗體檢測RN

30、A探針。,根據(jù)是否檢測到RNA判斷RNA是否被酶消化,也就是蛋白復(fù)合物是否可以保護RNA,抵抗RNA酶的消化。,,,在圖A中,當(dāng)加入0.005 μg/ml 的RNA酶時N-RNA的條帶變得分散,這可是由于復(fù)合物的局部分解照成的,逐漸增加RNA的量,發(fā)現(xiàn)依然能檢測到RNA,說明N-RNA復(fù)合物可以保護RNA免遭酶的消化。圖B,C為突變的蛋白復(fù)合物,在加入RNA酶后,條帶消失,RNA被消化。由以上的實驗可知這兩個類型的突變蛋白與RNA的親

31、和性很低,不能有效與蛋白結(jié)合形成復(fù)合物,所以很快被消化。Free RNA是只有RNA探針的對照,同樣加入RNA酶后條帶消失,被消化。,方法,結(jié)果,謝 謝 !,番茄斑萎病毒TSWV,TSWV是番茄斑萎病毒屬(病原拉丁學(xué)名Tomato spotted wilt virus)的代表種。屬于布尼亞病毒科( Bunia virus)病毒粒子為球形,直徑約85nm,表面有一層膜包裹,膜外層由5nm厚幾乎連續(xù)的突起層組成,染色較包膜要深,純化的病

32、毒粒子有時出現(xiàn)尾巴狀的擠出物。,核酸:該病毒包裹三分子線性ssRNA,基因組總長約為16600nt,其中ssRNA-L長8897nt,ssRNA-M長4821nt,ssRNA-S長2316nt,核酸約占病毒粒子重量的1%~2%。蛋白質(zhì):含有4種結(jié)構(gòu)蛋白,糖蛋白G1的分子量為78kDa,G2的分子量為58kDa, ,一種大的蛋白L可能是轉(zhuǎn)錄酶,分子質(zhì)量為200kDa。外殼蛋白N的分子質(zhì)量為28.8kDa基因組:三分體基因組,其中ssR

33、NA-L為負義,ssRNA-M和ssRNA-S為雙義,各個基因組片段具共有末端序列,在3‘端是CUCGUUA···,在5’端是AGAGCAAU···,區(qū)域互補而形成鍋柄狀結(jié)構(gòu)。番茄斑萎病毒的L片段編碼一個332kDa的多聚酶;M片段的互補鏈RNA編碼兩個糖蛋白G1和G2,病毒鏈RNA編碼33. 6kDa非結(jié)構(gòu)蛋白NSm;S片段的互補鏈RNA編碼28.8kDa外殼蛋白,病毒鏈RN

34、A編碼52.4kDa非結(jié)構(gòu)蛋白NSs。NSm蛋白在病毒系統(tǒng)侵染中起到胞間運動作用,NSs在寄主細胞中可形成擬結(jié)晶狀或纖維狀內(nèi)含體,其功能未知。該屬有6種病毒的L,M,S三個RNA片段已測序或部分測序。,,同源建模Homology Modeling,基因復(fù)制和趨異進化機制產(chǎn)生了同源蛋白質(zhì)族系。蛋白質(zhì)的同源性使人們有可能根據(jù)已知蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)去推測未知結(jié)構(gòu)的同源蛋白質(zhì)的初步結(jié)構(gòu)。人們通過對類似蛋白空間結(jié)構(gòu)的對比發(fā)現(xiàn),蛋白三維結(jié)構(gòu)比蛋白質(zhì)的

35、一級結(jié)構(gòu)更加保守,而后者又比DNA序列更為保守。氨基酸殘基的替換通常發(fā)生在蛋白表面回折區(qū)域,蛋白的主鏈結(jié)構(gòu),特別是疏水核心的結(jié)構(gòu)受序列變異的影響很小。因此,用類似物來預(yù)測蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)是比較可靠的方法,利用同源蛋白質(zhì)進行結(jié)構(gòu)建模,其基本出發(fā)點是同一家族蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上得保守性比序列保守性更強。當(dāng)序列相似性大于30%時,同源模型的可靠性很高,否則,結(jié)構(gòu)預(yù)測的較差。,同源建模法是現(xiàn)在最為成熟的預(yù)測方法,不但有商業(yè)化軟件(I-TASSER htt

36、p://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/ )可以使用,而且有自動同源建模網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器對公眾免費開放,比如瑞士生物信息研究所的SWISS-MOD-EL,丹麥技術(shù)大學(xué)生物序列分析中心的CPHmodels等。,,Ni-NTA親和層析法純化蛋白,純化帶有組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白的常見方法。,原理:純化用的Ni柱中的氯化鎳或者硫酸鎳可以與有組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白結(jié)合,組蛋白標(biāo)簽一般是6個組氨酸。在蛋白上樣后,帶有

37、組氨酸標(biāo)簽的蛋白特異性的結(jié)合到柱子里,其他蛋白流出。洗脫:Ni柱上得氯化鎳或硫酸鎳也可以與咪唑結(jié)合,并且結(jié)合能力較蛋白強,這時候用咪唑梯度洗脫,咪唑競爭性的結(jié)合到柱上,重組蛋白就被洗脫了。收集浸出液,透析過濾掉殘留的咪唑,就得到了純化的重組蛋白。,,藍色溫和凝膠電泳,為了研究哺乳動物和真菌線粒體中的蛋白復(fù)合物,人們建立了一種溫和膠電泳系統(tǒng),并稱之為藍色溫和凝膠電泳(Blue Native Gel Electrophoresis

38、 BN-PAGE)。該電泳系統(tǒng)是常見分離蛋白復(fù)合物的方法。,電泳之前,在蛋白樣品中加入考馬斯亮藍( Coomassie Brilliant Blue G-250)使蛋白帶上負電荷,同時不破壞蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu),使蛋白復(fù)合物在近似天然的狀態(tài)下分離。,該該電泳系統(tǒng)有兩種凝膠系統(tǒng)。一種是梯度凝膠,可以分離不同大小分子量的蛋白復(fù)合物。另一種是勻膠系統(tǒng),主要分離具有相似分子量的蛋白復(fù)合物。一般情況下都用丙烯酰胺濃度梯度膠,在極少的情況下使用勻膠系統(tǒng)

39、。,,,凝膠遷移或電泳遷移率實驗,凝膠遷移或電泳遷移率實驗( Electrophoretic mobility shift assay EMSA)是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù),可用于定性和定量分析。這一技術(shù)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白,目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用,在該實驗中,3nmol的DIG標(biāo)記的RNA探針分別與逐漸增多的N蛋白和突變N蛋白混合,反應(yīng)體系中加入10 μl的

40、結(jié)合緩沖液,并且一同在室溫下保溫10min,使探針與蛋白結(jié)合。然后在含有TBE緩沖液的1%瓊脂糖中電泳。最后用DIG免疫抗體檢測探針。從而分析RNA與蛋白的作用。,,濾膜結(jié)合法測定蛋白復(fù)合物的解離常數(shù),該過濾系統(tǒng)由兩層膜構(gòu)成,第一層是硝酸纖維素薄膜,第二層是尼龍膜。由于RNA探針帶負電,硝酸纖維素薄膜也帶負電,所以RNA可以透過。而大部分蛋白的表面都帶有正電荷,所以蛋白不能透過,同樣蛋白核酸的復(fù)合也不能透過。通過定量過濾液中的RNA以及

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