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1、(MTT方法大全mtt)什么是MTTMTT溶液的配制方法|MTT濃度|MTT法實(shí)驗(yàn)步驟|MTT溶液|whymeet2010011922:02MTTMTT方法大全方法大全mtt(mtt)mtt(mtt)什么是什么是MTTMTTMTTMTT溶液的配制方法溶液的配制方法|MTT|MTT濃度濃度|MTT|MTT法實(shí)驗(yàn)步驟法實(shí)驗(yàn)步驟|MTT|MTT溶液溶液|whymeetwhymeetMTT方法大全mtt(mtt)什么是MTTMTT溶液的配制方法

2、|MTT濃度|MTT法實(shí)驗(yàn)步驟|MTT溶液|whymeet其它的聲音：1.最好用570nm波長的濾光片，因?yàn)镸TT在這個波長的吸光度是峰值，換句話說靈敏度高。用其它波長的也有，一般是490nm，但我的經(jīng)驗(yàn)靈敏度降低一半。2.我們用的BIOTEK公司的ELx800一般值在2以下都是可靠的如果復(fù)孔之間值相差太大就要考慮是否是實(shí)驗(yàn)過程中的誤差.我曾經(jīng)看到園子的有些帖子報道說OD值大概在0.21.2范圍內(nèi)與活細(xì)胞數(shù)有較好的線性關(guān)系，但OD值在0

3、.30.9范圍內(nèi)可能更佳，若你的OD值不在這個范圍內(nèi)則你實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞數(shù)可能不太合適，應(yīng)調(diào)整你的細(xì)胞數(shù)。邊緣效應(yīng)96孔板四周一圈的孔一般只做空白，不養(yǎng)細(xì)胞，否則這四行的數(shù)據(jù)會偏高或偏低96孔板在培養(yǎng)箱中，由于濕度不夠，而培養(yǎng)箱由于具有一定的溫度，由于溫度梯度使得邊緣的孔水分蒸發(fā)較快，導(dǎo)致培養(yǎng)基中各種成分濃度變化增大，導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)不同。對于這種現(xiàn)象，要保證培養(yǎng)箱中的濕度，減少開關(guān)培養(yǎng)箱的次數(shù)和時間。解決方法:將孔板周圍的一圈孔全部不用，影響非

4、常大，而且最外一圈一定要加水、PBS或者培養(yǎng)液，只要能防止蒸發(fā)就可以.實(shí)驗(yàn)前應(yīng)明確的問題1.選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。一般情況下，96孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細(xì)胞長滿時約有105個細(xì)胞。但由于不同細(xì)胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行MTT試驗(yàn)前，要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長曲線，確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時間，以保證培養(yǎng)終止致細(xì)胞過滿。這樣，才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細(xì)胞數(shù)呈的線性關(guān)系。否則細(xì)胞數(shù)太多

5、敏感性降低，太少觀察不到差異。2.2.藥物濃度的設(shè)定。一定要多看文獻(xiàn)，參考別人的結(jié)果再定個比較大的范圍先初篩。根據(jù)自己初篩的藥物濃度的設(shè)定。一定要多看文獻(xiàn)，參考別人的結(jié)果再定個比較大的范圍先初篩。根據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃度和時間范圍再細(xì)篩。切記！否則，可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時結(jié)果縮小濃度和時間范圍再細(xì)篩。切記！否則，可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。間。3.時間點(diǎn)的設(shè)定。在不同時間點(diǎn)的測定ODOD值

6、，輸入值，輸入excelexcel表，表，最后得到不同時間點(diǎn)的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時候變得平坦了（到了平臺期）那個時間點(diǎn)應(yīng)該就是最好的時間點(diǎn)（因?yàn)檫@個時候的細(xì)胞增殖抑制表現(xiàn)的最明顯）。4.培養(yǎng)時間。200ul的培養(yǎng)液對于10的4～5次方的增殖期細(xì)胞來說，很難維持68h，如果營養(yǎng)不夠的話，細(xì)胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結(jié)果，我們是在48h換液的。定容1L貼壁細(xì)胞：1.收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔

7、加入100ul鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度至100010000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。2.5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）加入濃度梯度的藥物原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般57個梯度每孔100ul設(shè)35個復(fù)孔.建議設(shè)5個，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況3.5%CO2，37℃孵育1648小時，倒置顯微鏡下觀察。4.每孔加入20ulMTT溶液（5mgml，即0.5

8、%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖23遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。5.終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。6.每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。7.同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）懸浮細(xì)胞：1）收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸

9、液濃度1106ml，按次序?qū)ⅱ傺a(bǔ)足的1640（無血清）培養(yǎng)基40ul；②加ActinomycinD（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋lgml，需預(yù)試尋找最佳稀釋度，1:101:20)；③需檢測物10ul；④細(xì)胞懸液50ul（即5104cell孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設(shè)對照（加100(儲存液1001640）。2）置37℃，5%CO2孵育1648小時，倒置顯微鏡下觀察。3）每孔加入10ulMTT溶液（5mgm

10、l，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。（懸浮細(xì)胞推薦使用WST1，培養(yǎng)4h后可跳過步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值）4）離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值。5）同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、