引物設(shè)計的詳細(xì)步驟

1、一、引物設(shè)計一、引物設(shè)計stepbystep1、在NCBI上搜索到目的基因，找到該基因的mRNA，在CDS選項(xiàng)中，找到編碼區(qū)所在位置，在下面的igin中，Copy該編碼序列作為軟件查詢序列的候選對象。2、用PrimerPremier5搜索引物①打開PrimerPremier5，點(diǎn)擊FileNewDNAsequence出現(xiàn)輸入序列窗口，Copy目的序列在輸入框內(nèi)（選擇As），此窗口內(nèi)，序列也可以直接翻譯成蛋白。點(diǎn)擊Primer進(jìn)入引物窗口

2、。②此窗口可以鏈接到“引物搜索”、“引物編輯”以及“搜索結(jié)果”選項(xiàng)，點(diǎn)擊Search按鈕，進(jìn)入引物搜索框，選擇“PCRprimers”，“Pairs”，設(shè)定搜索區(qū)域和引物長度和產(chǎn)物長度。在SearchParameters里面，可以設(shè)定相應(yīng)參數(shù)。一般若無特殊需要，參數(shù)選擇默認(rèn)即可，但產(chǎn)物長度可以適當(dāng)變化，因?yàn)?00～200bp的產(chǎn)物電泳跑得較散，所以可以選擇300～500bp.③點(diǎn)擊OK，軟件即開始自動搜索引物，搜索完成后，會自動跳出結(jié)果

3、窗口，搜索結(jié)果默認(rèn)按照評分（Rating）排序，點(diǎn)擊其中任一個搜索結(jié)果，可以在“引物窗口”中，顯示出該引物的綜合情況，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各種信息等。④對于引物的序列，可以簡單查看一下，避免出現(xiàn)下列情況：3’不要出現(xiàn)連續(xù)的3個堿基相連的情況，比如GGG或CCC，否則容易引起錯配。此窗口中需要著重查看的包括：Tm應(yīng)該在55～70度之間，GC％應(yīng)該在45％～55％間，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2

4、度以下較好。該窗口的最下面列出了兩條引物的二級結(jié)構(gòu)信息，包括，發(fā)卡，二聚體，引物間交叉二聚體和錯誤引發(fā)位置。若按鈕顯示為紅色，表示存在該二級結(jié)構(gòu)，點(diǎn)擊該紅色按鈕，即可看到相應(yīng)二級結(jié)構(gòu)位置圖示。最理想的引物，應(yīng)該都不存在這些二級結(jié)構(gòu)，即這幾個按鈕都顯示為“None”為好。但有時很難找到各個條件都滿足的引物，所以要求可以適當(dāng)放寬，比如引物存在錯配的話，可以就具體情況考察該錯配的效率如何，是否會明顯影響產(chǎn)物。對于引物具體詳細(xì)的評價需要借助于O

5、ligo來完成，Oligo自身雖然帶有引物搜索功能，但其搜索出的引物質(zhì)量感覺不如Primer5.⑤在Primer5窗口中，若覺得某一對引物合適，可以在搜索結(jié)果窗口中，點(diǎn)擊該引物，然后在菜單欄，選擇FilePrintCurrentpair，使用PDF虛擬打印機(jī)，即可轉(zhuǎn)換為Pdf文檔，里面有該引物的詳細(xì)信息。3、用Oligo驗(yàn)證評估引物①在Oligo軟件界面，F(xiàn)ile菜單下，選擇Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，該序列已經(jīng)

6、被保存為Seq文件），會跳出來兩個窗口，分別為InternalStability（DeltaG）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，點(diǎn)擊最左下角的按鈕，會出來引物定位對話框，輸入候選的上游引物序列位置（Primer5已經(jīng)給出）即可，而引物長度可以通過點(diǎn)擊Change－Currentoligolength來改變。定位后，點(diǎn)擊Tm窗口的Upper按鈕，確定上游引物，同樣方法定位下游引物位置，點(diǎn)擊Lower按鈕，確定下游引物。引物確定后，即可以充分

7、利用Analyze菜單中各種強(qiáng)大的引物分析功能了。②Analyze中，第一項(xiàng)為Keyinfo，點(diǎn)擊edprimers，會給出兩條引物的概括性信息，其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearestneighbmethod計算，會比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中還給出引物的DeltaG和3’端的DeltaG.3’端的DeltaG過高，會在錯配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引起DNA聚合反應(yīng)因此此項(xiàng)絕對值應(yīng)該小些，最好不要超過9。③A

8、nalyze中第二項(xiàng)為DuplexFmation，即二聚體形成分析，可以選擇上游引物或下游引物，分析上游引物間二聚體形成情況和下游引物間的二聚體情況，還可以選擇UpperLower，即上下游引物之間的二聚體形成情況。引物二聚體是影響PCR反應(yīng)異常的重要因素，因此應(yīng)該避免設(shè)計的引物存在二聚體，至少也要使設(shè)計的引物形成的二聚體是不穩(wěn)定的，即其DeltaG值應(yīng)該偏低，一般不要使其超過4.5kcalmol，結(jié)合堿基對不要超過3個。Oligo此項(xiàng)

9、的分析窗口中分別給出了3’端和整個引物的二聚體圖示和DeltaG值。④Analyze中第三項(xiàng)為HairpinFmation，即發(fā)夾結(jié)構(gòu)分析?？梢赃x擇上游或者下游引物，同樣，DeltaG值不要超過4.5kcalmol，堿基對不要超過3個。Analyze中第四項(xiàng)為CompositionTm，會給出上游引物、下游引物和產(chǎn)物的各個堿基的組成比例和Tm值。上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之間的GC％不要相差太大。Tm值共

10、有3個，分別采用三種方法計算出來，包括nearestneighbmethod、％GCmethod和2(A＋T)＋4(G＋C)method，最后一種應(yīng)該是Primer5所采用的方法，Tm值可以控制在50～70度之間。④錯配和二聚體誰輕誰重，丁香園戰(zhàn)友覺得“到致命的程度”誰都重要，在設(shè)計的時候，盡量兩個都不得罪。⑤GC含量并非不重要，它直接影響引物各端穩(wěn)定性，3端來兩個G或C穩(wěn)定性就上去了，粘在模板上很牢。所以丁香園戰(zhàn)友設(shè)計引物的時候，會盡