引物設(shè)計原則(必看)

1、mi引物設(shè)計原則1.引物的長度一般為1530bp，常用的是1827bp，但不應(yīng)大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進行反應(yīng)。2.引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。引物3’端出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發(fā)機率增加。3.引物3’端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位堿基為

2、A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應(yīng)當避免在引物的3’端使用堿基A。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導致PCR反應(yīng)失敗。5’端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物。4.引物序列的GC含量一般為4060%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。5.引物所對應(yīng)模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復性條件最佳。Tm值的計算有多種方法，如按公式Tm＝4(GC)＋2(AT)，在Oligo軟件中使用的是

3、最鄰近法(thenearestneighbmethod)。6.ΔG值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應(yīng)當選用3’端ΔG值較低（絕對值不超過9），而5’端和中間ΔG值相對較高的引物。引物的3’端的ΔG值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。7.引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高（超過4.5kcalmol）易導致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進行。8.對引物

4、的修飾一般是在5’端增加酶切位點，應(yīng)根據(jù)下一步實驗中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。引物序列應(yīng)該都是寫成53方向的，Tm之間的差異最好控制在1度之內(nèi)，另外我覺得擴增長度大一些比較好，500bp左右。要設(shè)計引物首先要找到DNA序列的保守區(qū)。同時應(yīng)預(yù)測將要擴增的片段單鏈是否形成二級結(jié)構(gòu)。如這個區(qū)域單鏈能形成二級結(jié)構(gòu)，就要避開它。如這一段8.引物的3′端引物的延伸是從3′端開始的，不能進行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能，

5、除在特殊的PCR（ASPCR）反應(yīng)中，引物3′端不能發(fā)生錯配。在標準PCR反應(yīng)體系中，用2UTaqDNA聚合酶和800μmolLdNTP（四種dNTP各200μmolL）以質(zhì)粒（103拷貝）為模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循環(huán)參數(shù)擴增HIV1gag基因區(qū)的條件下，引物3′端錯配對擴增產(chǎn)物的影響是有一定規(guī)律的。A∶A錯配使產(chǎn)量下降至120，A∶G和C∶C錯七下降至1100。引物A：模板G與引物G：模板A錯配對P

6、CR影響是等同的。9.引物的5′端引物的5′端限定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。10.密碼子的簡并如擴增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增特異性與效率。Hairpin發(fā)卡結(jié)構(gòu)如果自由能值大于

7、0則該結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定從而不會干擾反應(yīng)如果自由能值小于0則該結(jié)構(gòu)可以干擾反應(yīng)二聚體可以在序列相同的兩條引物或正反向。引物之間形成如果配對區(qū)域在3末端問題會更為嚴重3末端配對很容易引起引物二聚體擴增使PairRating匹配度評分匹配度低的引物對常常不太有效是因為在同樣退火溫度下Tm低的引物決定擴增的特異性而Tm高的引物更易于形成非特異性結(jié)合而造成錯誤的起始【1】引物的長度以15－30bp為宜，否則會影響擴增的特異性?！?】】堿基盡可能隨機分布