1.微生態(tài)制劑的質(zhì)量鑒別與選擇

1、微生態(tài)制劑的質(zhì)量鑒別與選擇、檢測指標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)張日俊（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)飼料生物技術(shù)實驗室，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京海淀，100193）微生態(tài)制劑（農(nóng)業(yè)部官方稱為“微生物飼料添加劑”）在20世紀(jì)70年代興起時，被認(rèn)為只有活的微生物才能起到微生態(tài)的平衡作用，因此認(rèn)定微生態(tài)制劑是活菌制劑，甚至有一段時間，把微生態(tài)制劑就稱為“活菌制劑”。但隨著科學(xué)研究的不斷深入，大量資料證明，死菌體、菌體成分、代謝產(chǎn)物也具有調(diào)整微生態(tài)失調(diào)的功效。因此，在1994

2、年德國海德堡召開的國際微生態(tài)學(xué)術(shù)討論會上，修改了微生態(tài)制劑（益生菌）定義：“益生菌是含活菌和（或）死菌，包括其組分和產(chǎn)物的活菌制品，經(jīng)口或經(jīng)由其它粘膜途徑投入，旨在改善黏膜表面處微生物或酶的平衡，或者刺激特異性或非特異性免疫機(jī)制”。人們對活菌的作用比較容易理解，而對死菌的作用了解甚少，有資料證明，從電鏡也能直接觀察到死菌體也可黏附在腸壁，排斥有害菌，從而調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡；菌體的細(xì)胞壁成分——脂磷壁酸（LTA）及胞壁肽聚糖（PG），二者都能

3、抑制腐敗菌的致癌作用，并有很強(qiáng)的免疫激活作用。死菌體的特點是質(zhì)量較穩(wěn)定，比活菌更安全，并可以與抗生素同時使用。代謝產(chǎn)物是指細(xì)菌在生命活動過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物（排泄物），如酸性物質(zhì)及細(xì)菌素對有害菌有拮抗、殺滅作用，細(xì)菌分解食物后的氨基酸以及合成的維生素、酶具有營養(yǎng)作用，菌體碎片對動物體也有免疫促進(jìn)作用。代謝產(chǎn)物的特點是對動物體的作用較快。按照最新的益生菌概念內(nèi)涵來理解，則給微生態(tài)制劑的質(zhì)量評定增加了不少困難。即從成分上至少包括三個方面：活

4、菌數(shù)量、死菌體含量、代射產(chǎn)物的種類及含量。FAOWHO對益生菌也作了定義：益生菌是活的微生物，當(dāng)攝入足夠數(shù)量時，對宿主起有益健康作用。大家公認(rèn)的觀點是：益生菌首先在銷售過程中要保持活性（存活），而且在動物飼用后還要抵抗胃液膽汁的強(qiáng)酸性消化作用。在國標(biāo)《微生物飼料添加劑技術(shù)通則（NYT1442007）》（以下簡稱《通則》）中指出，微生物飼料添加劑是指在飼料中添加或直接飼喂給動物的微生物或微生物及其培養(yǎng)物，參與腸內(nèi)微生態(tài)平衡或者刺激特異性或

5、非特異性免疫功能、具有促進(jìn)動物生長和提高飼料轉(zhuǎn)化效率的微生物制劑。在此處的定義中，顯然忽略了“死菌”成分和“改善腸道酶的平衡”的功能。作為官方規(guī)定，以“嚴(yán)格”為好，由于死菌會給質(zhì)量評定帶來許多困難。由于除《微生物飼料添加劑技術(shù)通則》外，微生物飼料添加劑還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，因此，目前還要根據(jù)執(zhí)法部門——農(nóng)業(yè)部的《微生物飼料添加劑技術(shù)通則》來進(jìn)行質(zhì)量評定。1微生態(tài)制劑產(chǎn)品最常見的質(zhì)量問題有哪些，如何快速鑒別微生態(tài)制劑產(chǎn)品最常見的質(zhì)量問題有哪些

6、，如何快速鑒別1.1微生態(tài)制劑最常見的質(zhì)量問題1.1.1菌種成分標(biāo)示不明、擴(kuò)大功能、使用技術(shù)不明確有些微生態(tài)制劑不標(biāo)明菌種和主要成分，難以進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)督和檢驗；還有些企業(yè)任意擴(kuò)大微生態(tài)制劑的作用和用途，用法與用量含糊不清或千篇一律，導(dǎo)致目前市場上微生態(tài)制劑產(chǎn)品參差不齊，用法與用量等技術(shù)內(nèi)容不完善，難以確保使用的有效性。1.1.2活菌量標(biāo)示值與實際值不相符、甚至活菌很少微生態(tài)制劑中的活菌數(shù)是闡明其質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。活菌制劑在飼料加工、運(yùn)輸

7、、貯存過程中容易失去活性。一些廠家的微生態(tài)產(chǎn)品的標(biāo)示值與實際含量不符，通常表現(xiàn)為標(biāo)示值遠(yuǎn)大于保證值，即微生態(tài)制劑中能添加到飼料的中有效活菌數(shù)（指每克成品當(dāng)中所含有的有效活菌數(shù)量）。在國外產(chǎn)品也有類似的問題，如南非的Elliot和Teversham（2004）評價了9個從美國和歐洲進(jìn)口的益生素產(chǎn)品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有59產(chǎn)品的標(biāo)示值與實測值相符，39的產(chǎn)品標(biāo)示的菌種與實際相符。1.1.3雜菌污染在確定購買之前，一要觀其色，即觀察微生態(tài)制劑的色澤

8、，比較理想的粉狀微生態(tài)制劑應(yīng)該是白色或黃白色；二要聞其味，應(yīng)該有發(fā)酵制品的典型味道，即酸味或酸香味；三要查其粒，就是觀察粉狀微生態(tài)制劑的顆粒細(xì)度，因為粒度大的不容易與飼料混合均勻，原則上應(yīng)達(dá)到80目（接近食用玉米面的細(xì)度）。3微生態(tài)制劑產(chǎn)品的品質(zhì)檢測的指標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)微生態(tài)制劑產(chǎn)品的品質(zhì)檢測的指標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)與微生態(tài)制劑產(chǎn)品品質(zhì)密切相關(guān)的指標(biāo)有兩大類：①有效活菌數(shù)；②衛(wèi)生指標(biāo)。3.1有效活菌數(shù)的檢測目前微生態(tài)制劑中常用的微生物主要有酵母菌乳酸菌、芽

9、孢桿菌和光合細(xì)菌等，檢測活菌含量的方法，主要是平板培養(yǎng)計數(shù)法，雖然有一些快速測定微生物總菌數(shù)和有害菌的方法，如ATP法（生物化學(xué)發(fā)光檢測方法）、免疫法、阻抗法和顯色培養(yǎng)基法在國外應(yīng)用相當(dāng)成功，但在我國由于儀器設(shè)備和檢測條件的限制，還沒有普及。因此，主要還是使用顯微鏡檢測（鏡檢法）和平板計數(shù)法。3.1.1樣品細(xì)菌總數(shù)測定方法可參照國標(biāo)《飼料中細(xì)菌總數(shù)的測定方法（GB1309391）》，也可參照采用國際標(biāo)準(zhǔn)《食品和動物飼料中微生物學(xué)檢驗方法

10、（IS048331978）》進(jìn)行測定。活菌數(shù)測定是重要的指標(biāo)，根據(jù)不同菌種的培養(yǎng)要求，選擇厭氧、微需氧、需氧條件培養(yǎng)，必須規(guī)定培養(yǎng)方法及條件。一般來說，細(xì)菌總數(shù)測定，無論用GB130939或IS048331978都會低估總菌數(shù)，因為用同一條件來培養(yǎng)不同生長特性的微生物，總有一種或幾種微生物生長不良或不能生長。因此，為獲得準(zhǔn)確的總菌數(shù)結(jié)果，最好采用分類計數(shù)法，即分別用乳酸菌、酵母（包括真菌）、芽孢桿菌專用培養(yǎng)基，并選擇適合各類菌的培養(yǎng)條件

11、進(jìn)行分類計數(shù)，最后將各種菌數(shù)求即為總菌數(shù)。3.1.2酵母菌數(shù)的檢測將樣品經(jīng)水適當(dāng)稀釋后可通過血球板計數(shù)法得酵母細(xì)胞的數(shù)量；而檢測酵母死與活的方法主要是通過用美藍(lán)染色制成水浸片，由于美藍(lán)是一種無毒性染料，它的氧化型是藍(lán)色的，而還原型是無色的，用它來對酵母的活細(xì)胞進(jìn)行染色，由于細(xì)胞中新陳代謝作用，使細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能使美藍(lán)從藍(lán)色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型，所以酵母的活細(xì)胞無色，而對于死細(xì)胞或代謝緩慢的老細(xì)胞，則因它們無此還原能力或還

12、原能力極弱，而被美藍(lán)染成藍(lán)色或淡藍(lán)色。為了準(zhǔn)確測量活酵母的數(shù)量，還可采用平板計數(shù)法，可參照《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗霉菌和酵母計數(shù)（GBT4789.152003）》進(jìn)行。兩種計數(shù)方法相比，顯微鏡直接計數(shù)法隨機(jī)性大，所以對菌體數(shù)量不能做出較為宏觀，全面的反應(yīng)。但其優(yōu)點是快速，觀察到馬上可以計數(shù)。平板菌落計數(shù)法最大的缺點是速度慢，需要平板上長出菌落一段時間后才能計數(shù)，但是由于平板菌落計數(shù)法通常做梯度稀釋，所以計數(shù)的線性范圍大，由于是菌懸液涂布，

13、所以比較均勻，能較好地反應(yīng)菌落的疏密程度，重復(fù)性、平行性很好，是經(jīng)典的計數(shù)方法，一般情況下，可在24～36h內(nèi)獲得檢驗結(jié)果。3.1.3芽孢桿菌的檢測主要參照國標(biāo)《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定（GBT4789.22003）》，使用NAMn培養(yǎng)基（蛋白胨0.5％、葡萄糖0.5％、牛肉膏0.5％、磷酸二氫鉀0.3％、瓊脂3％，pH值7.5～7.6，121℃滅菌30min備用）。測定時，將固體樣品作適當(dāng)倍數(shù)稀釋，同時在搖瓶中加入玻璃珠粒30