1.微生態(tài)制劑的質(zhì)量鑒別與選擇

1、微生態(tài)制劑的質(zhì)量鑒別與選擇、檢測(cè)指標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)張日俊（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)飼料生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京海淀，100193）微生態(tài)制劑（農(nóng)業(yè)部官方稱為“微生物飼料添加劑”）在20世紀(jì)70年代興起時(shí)，被認(rèn)為只有活的微生物才能起到微生態(tài)的平衡作用，因此認(rèn)定微生態(tài)制劑是活菌制劑，甚至有一段時(shí)間，把微生態(tài)制劑就稱為“活菌制劑”。但隨著科學(xué)研究的不斷深入，大量資料證明，死菌體、菌體成分、代謝產(chǎn)物也具有調(diào)整微生態(tài)失調(diào)的功效。因此，在1994

2、年德國(guó)海德堡召開(kāi)的國(guó)際微生態(tài)學(xué)術(shù)討論會(huì)上，修改了微生態(tài)制劑（益生菌）定義：“益生菌是含活菌和（或）死菌，包括其組分和產(chǎn)物的活菌制品，經(jīng)口或經(jīng)由其它粘膜途徑投入，旨在改善黏膜表面處微生物或酶的平衡，或者刺激特異性或非特異性免疫機(jī)制”。人們對(duì)活菌的作用比較容易理解，而對(duì)死菌的作用了解甚少，有資料證明，從電鏡也能直接觀察到死菌體也可黏附在腸壁，排斥有害菌，從而調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡；菌體的細(xì)胞壁成分——脂磷壁酸（LTA）及胞壁肽聚糖（PG），二者都能

3、抑制腐敗菌的致癌作用，并有很強(qiáng)的免疫激活作用。死菌體的特點(diǎn)是質(zhì)量較穩(wěn)定，比活菌更安全，并可以與抗生素同時(shí)使用。代謝產(chǎn)物是指細(xì)菌在生命活動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物（排泄物），如酸性物質(zhì)及細(xì)菌素對(duì)有害菌有拮抗、殺滅作用，細(xì)菌分解食物后的氨基酸以及合成的維生素、酶具有營(yíng)養(yǎng)作用，菌體碎片對(duì)動(dòng)物體也有免疫促進(jìn)作用。代謝產(chǎn)物的特點(diǎn)是對(duì)動(dòng)物體的作用較快。按照最新的益生菌概念內(nèi)涵來(lái)理解，則給微生態(tài)制劑的質(zhì)量評(píng)定增加了不少困難。即從成分上至少包括三個(gè)方面：活

4、菌數(shù)量、死菌體含量、代射產(chǎn)物的種類及含量。FAOWHO對(duì)益生菌也作了定義：益生菌是活的微生物，當(dāng)攝入足夠數(shù)量時(shí)，對(duì)宿主起有益健康作用。大家公認(rèn)的觀點(diǎn)是：益生菌首先在銷(xiāo)售過(guò)程中要保持活性（存活），而且在動(dòng)物飼用后還要抵抗胃液膽汁的強(qiáng)酸性消化作用。在國(guó)標(biāo)《微生物飼料添加劑技術(shù)通則（NYT1442007）》（以下簡(jiǎn)稱《通則》）中指出，微生物飼料添加劑是指在飼料中添加或直接飼喂給動(dòng)物的微生物或微生物及其培養(yǎng)物，參與腸內(nèi)微生態(tài)平衡或者刺激特異性或

5、非特異性免疫功能、具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和提高飼料轉(zhuǎn)化效率的微生物制劑。在此處的定義中，顯然忽略了“死菌”成分和“改善腸道酶的平衡”的功能。作為官方規(guī)定，以“嚴(yán)格”為好，由于死菌會(huì)給質(zhì)量評(píng)定帶來(lái)許多困難。由于除《微生物飼料添加劑技術(shù)通則》外，微生物飼料添加劑還沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，因此，目前還要根據(jù)執(zhí)法部門(mén)——農(nóng)業(yè)部的《微生物飼料添加劑技術(shù)通則》來(lái)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)定。1微生態(tài)制劑產(chǎn)品最常見(jiàn)的質(zhì)量問(wèn)題有哪些，如何快速鑒別微生態(tài)制劑產(chǎn)品最常見(jiàn)的質(zhì)量問(wèn)題有哪些

6、，如何快速鑒別1.1微生態(tài)制劑最常見(jiàn)的質(zhì)量問(wèn)題1.1.1菌種成分標(biāo)示不明、擴(kuò)大功能、使用技術(shù)不明確有些微生態(tài)制劑不標(biāo)明菌種和主要成分，難以進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)督和檢驗(yàn)；還有些企業(yè)任意擴(kuò)大微生態(tài)制劑的作用和用途，用法與用量含糊不清或千篇一律，導(dǎo)致目前市場(chǎng)上微生態(tài)制劑產(chǎn)品參差不齊，用法與用量等技術(shù)內(nèi)容不完善，難以確保使用的有效性。1.1.2活菌量標(biāo)示值與實(shí)際值不相符、甚至活菌很少微生態(tài)制劑中的活菌數(shù)是闡明其質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。活菌制劑在飼料加工、運(yùn)輸

7、、貯存過(guò)程中容易失去活性。一些廠家的微生態(tài)產(chǎn)品的標(biāo)示值與實(shí)際含量不符，通常表現(xiàn)為標(biāo)示值遠(yuǎn)大于保證值，即微生態(tài)制劑中能添加到飼料的中有效活菌數(shù)（指每克成品當(dāng)中所含有的有效活菌數(shù)量）。在國(guó)外產(chǎn)品也有類似的問(wèn)題，如南非的Elliot和Teversham（2004）評(píng)價(jià)了9個(gè)從美國(guó)和歐洲進(jìn)口的益生素產(chǎn)品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有59產(chǎn)品的標(biāo)示值與實(shí)測(cè)值相符，39的產(chǎn)品標(biāo)示的菌種與實(shí)際相符。1.1.3雜菌污染在確定購(gòu)買(mǎi)之前，一要觀其色，即觀察微生態(tài)制劑的色澤

8、，比較理想的粉狀微生態(tài)制劑應(yīng)該是白色或黃白色；二要聞其味，應(yīng)該有發(fā)酵制品的典型味道，即酸味或酸香味；三要查其粒，就是觀察粉狀微生態(tài)制劑的顆粒細(xì)度，因?yàn)榱６却蟮牟蝗菀着c飼料混合均勻，原則上應(yīng)達(dá)到80目（接近食用玉米面的細(xì)度）。3微生態(tài)制劑產(chǎn)品的品質(zhì)檢測(cè)的指標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)微生態(tài)制劑產(chǎn)品的品質(zhì)檢測(cè)的指標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)與微生態(tài)制劑產(chǎn)品品質(zhì)密切相關(guān)的指標(biāo)有兩大類：①有效活菌數(shù)；②衛(wèi)生指標(biāo)。3.1有效活菌數(shù)的檢測(cè)目前微生態(tài)制劑中常用的微生物主要有酵母菌乳酸菌、芽

9、孢桿菌和光合細(xì)菌等，檢測(cè)活菌含量的方法，主要是平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法，雖然有一些快速測(cè)定微生物總菌數(shù)和有害菌的方法，如ATP法（生物化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法）、免疫法、阻抗法和顯色培養(yǎng)基法在國(guó)外應(yīng)用相當(dāng)成功，但在我國(guó)由于儀器設(shè)備和檢測(cè)條件的限制，還沒(méi)有普及。因此，主要還是使用顯微鏡檢測(cè)（鏡檢法）和平板計(jì)數(shù)法。3.1.1樣品細(xì)菌總數(shù)測(cè)定方法可參照國(guó)標(biāo)《飼料中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定方法（GB1309391）》，也可參照采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)《食品和動(dòng)物飼料中微生物學(xué)檢驗(yàn)方法

10、（IS048331978）》進(jìn)行測(cè)定?；罹鷶?shù)測(cè)定是重要的指標(biāo)，根據(jù)不同菌種的培養(yǎng)要求，選擇厭氧、微需氧、需氧條件培養(yǎng)，必須規(guī)定培養(yǎng)方法及條件。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)菌總數(shù)測(cè)定，無(wú)論用GB130939或IS048331978都會(huì)低估總菌數(shù)，因?yàn)橛猛粭l件來(lái)培養(yǎng)不同生長(zhǎng)特性的微生物，總有一種或幾種微生物生長(zhǎng)不良或不能生長(zhǎng)。因此，為獲得準(zhǔn)確的總菌數(shù)結(jié)果，最好采用分類計(jì)數(shù)法，即分別用乳酸菌、酵母（包括真菌）、芽孢桿菌專用培養(yǎng)基，并選擇適合各類菌的培養(yǎng)條件

11、進(jìn)行分類計(jì)數(shù)，最后將各種菌數(shù)求即為總菌數(shù)。3.1.2酵母菌數(shù)的檢測(cè)將樣品經(jīng)水適當(dāng)稀釋后可通過(guò)血球板計(jì)數(shù)法得酵母細(xì)胞的數(shù)量；而檢測(cè)酵母死與活的方法主要是通過(guò)用美藍(lán)染色制成水浸片，由于美藍(lán)是一種無(wú)毒性染料，它的氧化型是藍(lán)色的，而還原型是無(wú)色的，用它來(lái)對(duì)酵母的活細(xì)胞進(jìn)行染色，由于細(xì)胞中新陳代謝作用，使細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能使美藍(lán)從藍(lán)色的氧化型變?yōu)闊o(wú)色的還原型，所以酵母的活細(xì)胞無(wú)色，而對(duì)于死細(xì)胞或代謝緩慢的老細(xì)胞，則因它們無(wú)此還原能力或還

12、原能力極弱，而被美藍(lán)染成藍(lán)色或淡藍(lán)色。為了準(zhǔn)確測(cè)量活酵母的數(shù)量，還可采用平板計(jì)數(shù)法，可參照《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)（GBT4789.152003）》進(jìn)行。兩種計(jì)數(shù)方法相比，顯微鏡直接計(jì)數(shù)法隨機(jī)性大，所以對(duì)菌體數(shù)量不能做出較為宏觀，全面的反應(yīng)。但其優(yōu)點(diǎn)是快速，觀察到馬上可以計(jì)數(shù)。平板菌落計(jì)數(shù)法最大的缺點(diǎn)是速度慢，需要平板上長(zhǎng)出菌落一段時(shí)間后才能計(jì)數(shù)，但是由于平板菌落計(jì)數(shù)法通常做梯度稀釋，所以計(jì)數(shù)的線性范圍大，由于是菌懸液涂布，

13、所以比較均勻，能較好地反應(yīng)菌落的疏密程度，重復(fù)性、平行性很好，是經(jīng)典的計(jì)數(shù)方法，一般情況下，可在24～36h內(nèi)獲得檢驗(yàn)結(jié)果。3.1.3芽孢桿菌的檢測(cè)主要參照國(guó)標(biāo)《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定（GBT4789.22003）》，使用NAMn培養(yǎng)基（蛋白胨0.5％、葡萄糖0.5％、牛肉膏0.5％、磷酸二氫鉀0.3％、瓊脂3％，pH值7.5～7.6，121℃滅菌30min備用）。測(cè)定時(shí)，將固體樣品作適當(dāng)倍數(shù)稀釋，同時(shí)在搖瓶中加入玻璃珠粒30