無菌工藝快速微生物檢測方法

1、無菌工藝快速微生物檢測方法無菌工藝快速微生物檢測方法自21世紀初以來，國際制藥工業(yè)界在無菌藥品生產領域開展了一項重要的檢測技術——快速微生物檢測（RMM，RapidMicrobiologicalMethods），包含快速檢出和鑒定。在多年制藥工業(yè)實踐中，許多實驗室發(fā)現當微生物養(yǎng)分被剝奪，或抗菌劑，如防腐劑、消毒劑、高溫蒸汽或去污染氣體的濃度達亞致死量時，微生物會發(fā)生應激，無法在傳統人工介質上復制培養(yǎng)。因為這種培養(yǎng)不能達到最佳復活條件，微

2、生物不能增殖。當這種情況發(fā)生時，無菌培養(yǎng)陰性不能證明產品沒有受到污染。另外，無菌培養(yǎng)需時較長，不能實時發(fā)現產品生產過程中發(fā)生的污染，不能使產品快速放行，增加倉儲時間和成本。于是，人們希望開發(fā)出新的微生物檢查、定量和鑒定方法。近年來生物檢測技術高速發(fā)展并迅速向制藥領域滲透。當前RMM各類技術平臺已經能夠檢測到多種微生物及變異微生物；能明確樣品中微生物的數目；識別微生物的屬，種和亞種。這些技術主要分為基于微生物培養(yǎng)的快速發(fā)現和鑒定技術、活細

3、胞識別鑒定技術和基因及芯片識別鑒定技術?；谖⑸锱囵B(yǎng)的快速發(fā)現和鑒定技術基于微生物培養(yǎng)的快速發(fā)現和鑒定技術是在微生物培養(yǎng)過程中早期快速發(fā)現微生物生長。電阻監(jiān)測系統能測量微生物生長過程中液體介質中電勢的變化。微生物生長過程中，較大的，不帶電的分子分解為較小的，高度帶電的分子，如蛋白質變成氨基酸，脂肪變成脂肪酸，多糖變成乳酸等。通過監(jiān)測電極間離子移動（電導率）或電極表面電荷數量（電容），檢查是否有微生物生長。bioMrieuxBactom

4、eter系統就是基于這一原理。微生物液體培養(yǎng)時會產生CO2，在密閉容器中，可通過監(jiān)測容器中CO2含量的變化來檢測微生物生長。BacTALERT系統設備是bioMrieux的第二代技術。該技術將微生物生長產生的二氧化碳擴散至液體乳膠傳感器，觸發(fā)顏色警報器，告知用戶檢測到微生物。GenzymeBiosurgery已將這種技術用于其細胞培養(yǎng)產品的快速無菌檢查。標記活細胞。接著整個細胞表面進行激光掃描，完成標記微生物的定量測定。系統完成標記和檢

5、測工藝大約需要90min。系統也可在數小時內，利用抗體和核酸探針進行特異微生物的檢測和定量測定。與傳統的介質培養(yǎng)法相比，利用這種技術獲得的微生物數量更多，更適宜用于環(huán)境應激類微生物即暴露在消毒劑或防腐劑中的微生物的檢測?；蚣靶酒R別鑒定技術基因識別鑒定是指利用基因擴增和檢測平臺，包括聚合酶鏈反應（PCR）、轉錄介導擴增(TMA)、16SrRNA分析、基因測序等方法進行的快速微生物檢測和鑒定。這些方法大多數用于檢測某種特異微生物是否存在

6、以及菌落的鑒別，可快速鑒定到屬、亞種和或系水平。這些方法需經細胞培養(yǎng)得到起始原料，如瓊脂表面的一個菌落，因此獲得最終結果的時間包括細胞培養(yǎng)的時間。聚合酶鏈反應（PCR）是基因檢測的基本技術。利用小的DNA片段即引物，在TaqDNA聚合酶作用下，能使目標序列進行數百萬次復制，便于被檢測，用于確定樣品中是否存在某種特異微生物。PCR和MS結合用于檢測和鑒別微生物，可以非常準確地知道每種含有DNA的底物的精確質量，因此可通過質譜對源于底物的P

7、CR目標序列進行高精度的測定。SequenomMassARRAY設備利用各種序列引物進行微生物鑒別。序列包括看家基因（多位點序列分型MLST）和16SrDNA。轉錄介導擴增（TMA）采用單鏈RNA，通過T7RNA聚合酶，每個周期產生數千個RNA擴增子，在15~30min內可完成10億次復制，其效率遠高于PCR。與PCR相比，利用TMA技術的其他優(yōu)勢還有：每個細胞只有唯一的DNA靶標，卻有數千個rRNA復制品，提高了命中靶標的可靠性；TM