實(shí)驗(yàn)論文 (8)

1、鹿茸多肽對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞增殖的影響鹿茸多肽對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞增殖的影響作者：陳曉東林建華作者單位：巴彥淖爾市醫(yī)院骨科，內(nèi)蒙古巴彥淖爾015000；福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院【摘要】目的：探討鹿茸多肽(PAP)對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞體外增殖的影響。方法：采用二次酶消化法獲得大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)并對(duì)第四代細(xì)胞進(jìn)行藥物干預(yù)，利用MTT比色、免疫組化檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期等方法來檢測(cè)各代次大鼠軟骨細(xì)胞和藥物干預(yù)后第四代軟

2、骨細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果：大鼠軟骨細(xì)胞隨傳代培養(yǎng)，MTT比色顯示增殖呈下降趨勢(shì)，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)PCNA表達(dá)減少，流式細(xì)胞術(shù)顯示細(xì)胞增殖指數(shù)下降PAP可以抑制這一趨勢(shì)促進(jìn)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞增殖能力。結(jié)論：PAP對(duì)傳代培養(yǎng)的大鼠軟骨細(xì)胞的增殖能力有明顯促進(jìn)作用?！娟P(guān)鍵詞】鹿茸多肽；大鼠；軟骨細(xì)胞；增殖基金項(xiàng)目：福建省科技計(jì)劃重大資助項(xiàng)目(2004Y018)EffectofPiloseAntlerPolypeptidesonProliferati

3、onofRatChondrocyteinVitroCHENXiaodong，LINJianhua(DepartmentofthopedicsBayannaoerHospitalBayannaoer015000China)AbstractObjective:Thepurposeofthepresentwastoinvestigatetheeffectofpiloseantlerpolypeptides(PAP)ontheprolifera

4、tionofratchondrocyteinvitro.Methods:Theratarticularchondrocyteswereisolatedbyenzymedigestionsubcultivatedinserial.The4thchondrocytewasinterferedwithPAP.Thechondrocytesofdifferentgenerationsthe4thmedicineinteferedgenerati

5、onweredetectedwiththemethodsofproliferatingcellnuclearantigenMTT(methylthiazolyltetrazolium)assayfproliferationFlowcytometryfanalysesofcellcycledistributionPI(proliferationindex).Results:Withchondrocytespassagetimeincrea

6、singtheproliferatingabilityofchondrocytesdescended.MTTassayshowedthattheproliferatingabilityofchondrocytesdecreasedtheexpressionofPCNAtaperedintheexperimentofimmunohistochemistryPIdescendedinflowcytometryfanalyses.PAPcan

7、inhibitthetendencystrengthentheproliferatingabilityofchondrocytesinserialsubcultivation.Conclusion:PAPcansignificantlyimproveproliferationofchondrocytesinserialsubcultivation.濃度的PAP培養(yǎng)基，分別加藥使各瓶培養(yǎng)基藥物終濃度為PAP5μgmL、PAP10μgmL、

8、PAP15μgmL；分別以上述不同含藥濃度培養(yǎng)基吹打混勻各瓶P3細(xì)胞，進(jìn)行傳代，使藥物干預(yù)組軟骨細(xì)胞進(jìn)入P4代。按實(shí)驗(yàn)要求調(diào)整細(xì)胞濃度，分別接種軟骨細(xì)胞于底面積25cm2培養(yǎng)瓶（細(xì)胞濃度5105mL）、6孔培養(yǎng)板（置入蓋玻片）（細(xì)胞濃度5105mL）、96孔培養(yǎng)板（細(xì)胞濃度4105mL），于37℃、5%CO2飽和濕度孵育箱中孵育，其中PAP分組參考劑量來源于前期實(shí)驗(yàn)［3］。2.2各代軟骨細(xì)胞MTT比色試驗(yàn)將不同代次大鼠軟骨細(xì)胞以5104

9、mL濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，常規(guī)培養(yǎng)24小時(shí)后用含體積分?jǐn)?shù)為5%FBS的αMEM培養(yǎng)，并分別加入PAP，使PAP終濃度為5、10、15μgmL加藥后分別繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，加入MTT溶液呈色。選擇490nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各個(gè)孔光吸收值。2.3各代軟骨細(xì)胞周期分析及增殖指數(shù)檢測(cè)將培養(yǎng)的待測(cè)各代軟骨細(xì)胞分別置5mL試管中，用PBS或生理鹽水洗2次，制成單細(xì)胞懸液，無水乙醇固定細(xì)胞，加入PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為5105～5106個(gè)細(xì)

10、胞加入1mLDNA熒光染料（PI），室溫下避光染色15分鐘，以流式細(xì)胞儀(BectonDickinsonFACScan，美國(guó))分析各代軟骨細(xì)胞周期及檢測(cè)增殖指數(shù)。2.4各代軟骨細(xì)胞免疫細(xì)胞化法檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞PCNA表達(dá)將不同代次軟骨細(xì)胞接種于6孔板，孔內(nèi)均預(yù)置一塊蓋玻片，常規(guī)培養(yǎng)48小時(shí)后取出蓋玻片，用免疫組織化學(xué)二步法檢測(cè)PCNA表達(dá)情況，結(jié)果分析：采用HPIAS21000高清晰度圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，測(cè)定PCNA陽性信號(hào)的面積

11、密度(Sv=PCNA陽性信號(hào)面積和窗口面積窗口數(shù))。2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法以上檢測(cè)均隨機(jī)取多個(gè)樣本，每個(gè)樣本多次重復(fù)。應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。進(jìn)行OnewayANOVA檢驗(yàn)和Pearson相關(guān)分析，定量資料實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3結(jié)果3.1各組軟骨細(xì)胞MTT比色結(jié)果MTT比色分析顯示：隨著軟骨細(xì)胞傳代培養(yǎng)，從P2代細(xì)胞至P4代軟骨細(xì)胞在傳代培養(yǎng)過程中細(xì)胞能量代謝呈下降趨勢(shì)，逐代相比OD值有顯著差