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1、抗生素抗生素發(fā)酵生酵生產(chǎn)工藝1.青霉素青霉素發(fā)酵工酵工藝的建立的建立對抗生素工抗生素工業(yè)有何意有何意義?青霉素是發(fā)現(xiàn)最早,最卓越的一種B內(nèi)酰胺類抗生素,它是抗生素工業(yè)的首要產(chǎn)品,青霉素是各種半合成抗生素的原料。青霉素的缺點(diǎn)是對酸不穩(wěn)定,不能口服,排泄快,對革蘭氏陰性菌無效。青霉素經(jīng)過擴(kuò)環(huán)后,形成頭孢菌素母核,成為半合成頭孢菌素的原料。2.如何根據(jù)青霉素生如何根據(jù)青霉素生產(chǎn)菌特性菌特性進(jìn)行發(fā)酵過程控制?程控制?青霉素在深層培養(yǎng)條件下,經(jīng)歷
2、7個不同的時期,每個時期有其菌體形態(tài)特性,在規(guī)定時間取樣,通過顯鏡檢查這些形態(tài)變化,用于工程控制。第一期:分生孢子萌發(fā),形成芽管,原生質(zhì)未分化,具有小泡。第二期:菌絲繁殖,原生質(zhì)體具有嗜堿性,類脂肪小顆粒。第三期:形成脂肪包含體,積累儲蓄物,沒有空洞,嗜堿性很強(qiáng)。第四期:脂肪包含體形成小滴并減少,中小空泡,原生質(zhì)體嗜堿性減弱,開始產(chǎn)生抗生素。第五期:形成大空泡,有中性染色大顆粒,菌絲呈桶狀。脂肪包含體消失,青霉素產(chǎn)量提高。第六期:出現(xiàn)個
3、別自溶細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)無顆粒,仍然桶狀,釋放游離氨,pH上升。第七期:菌絲完全自溶,僅有空細(xì)胞壁。一到四期為菌絲生長期,三期的菌體適宜為種子。四到五期為生產(chǎn)期,生產(chǎn)能力最強(qiáng),通過工藝措施,延長此期,獲得高產(chǎn)。在第六期到來之前發(fā)束發(fā)酵。3.青霉素青霉素發(fā)酵工程的控制原理及其關(guān)酵工程的控制原理及其關(guān)鍵點(diǎn)是什么?點(diǎn)是什么?控制原理:發(fā)酵過程需連續(xù)流加葡萄糖,硫酸銨以及前提物質(zhì)苯乙酸鹽,補(bǔ)糖率是最關(guān)鍵的控制指標(biāo),不同時期分段控制。在青霉素的生產(chǎn)中,
4、及時調(diào)節(jié)各個因素減少對產(chǎn)量的影響,如培養(yǎng)基,補(bǔ)充碳源,氮源,無機(jī)鹽流加控制,添加前體等;控制適宜的溫度和ph,菌體濃度。最后要注意消沫,影響呼吸代謝。4.青霉素提青霉素提煉工藝中采用了哪些中采用了哪些單元操作?元操作?青霉素不穩(wěn)定,發(fā)酵液預(yù)處理、提取和精制過程要條件溫和、快速,防止降解。提煉工藝包括如下單元操作:①預(yù)處理與過濾:在于濃縮青霉素,除去大部分雜質(zhì),改變發(fā)酵液的流變學(xué)特征,便于后續(xù)的分離純化過程。②萃?。浩湓硎乔嗝顾赜坞x酸易
5、溶于有機(jī)溶劑,而青霉素易溶于水。③脫色:萃取液中添加活性炭,除去色素,熱源,過濾,除去活性炭。④結(jié)晶:青霉素鉀鹽在乙酸丁酯中溶解度很小,在乙酸丁酯萃取液中加入乙酸鉀乙醇溶液,青霉素鉀鹽可直接結(jié)晶析出。氨基酸氨基酸發(fā)酵工酵工藝1.如何如何對谷氨酸谷氨酸發(fā)酵工酵工藝過藝過程進(jìn)行調(diào)控?控?發(fā)酵過程流加銨鹽、尿素、氨水等氮源,補(bǔ)充NH4;生物素適量控制在25μgL;pH控制在中性或微堿性;供氧充足;磷酸鹽適量。2.氨基酸生氨基酸生產(chǎn)菌有什么特性
6、,菌有什么特性,為什么什么?L谷氨酸發(fā)酵微生物的優(yōu)良菌株多在棒狀桿菌屬、小短桿菌屬、節(jié)桿菌屬和短桿菌屬中。具有下述共同特性:①細(xì)胞形態(tài)為短桿至棒狀;②無鞭毛,不運(yùn)動;③不形成芽孢;④革蘭氏陽性;⑤生物素缺陷型;⑥三羧酸循環(huán)、戊糖磷酸途徑突變;⑦在通氣培養(yǎng)條件下產(chǎn)生大量L谷氨酸。3.生物素在谷氨酸生物素在谷氨酸發(fā)酵過程中的作用是什么?程中的作用是什么?基因的抑制狀態(tài),活化基因,進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯,生成產(chǎn)物。適宜的誘導(dǎo)時間非常重要。誘導(dǎo)物的濃度
7、及其發(fā)酵溫度會影響表達(dá)量和產(chǎn)物存在形式?;瘜W(xué)誘導(dǎo)型啟動子:lzc、tac、T7等,誘導(dǎo)時間為對數(shù)生長期。溫度誘導(dǎo)型啟動子:PL、PR等,誘導(dǎo)時間為對數(shù)期或稍后一些?;蚬こ讨苹蚬こ讨扑幑に?.什么是基因工程菌,工程菌構(gòu)建的基本什么是基因工程菌,工程菌構(gòu)建的基本過程和各程和各階段的主要任段的主要任務(wù)是什么,所涉及基因工程是什么,所涉及基因工程原理是什么?原理是什么?將目的基因?qū)爰?xì)菌體內(nèi)使其表達(dá),產(chǎn)生所需要的蛋白的細(xì)菌稱為基因工程菌。工
8、程菌構(gòu)建的基本過程如下:目標(biāo)基因克?。≒CR、文庫篩選、化學(xué)合成)→表達(dá)載體構(gòu)建(酶切、鏈接)→遺傳轉(zhuǎn)化與篩選(外源基因?qū)肱c培養(yǎng))→工程菌(獲得新形狀、功能、產(chǎn)生物質(zhì))酶切:在特異位點(diǎn)上催化雙鏈DNA分子的斷裂,產(chǎn)生相應(yīng)的限制性片段。(DNA緩沖液限制性內(nèi)切酶;37℃,1小時;加熱、加EDTA終止;電泳檢查酶切完整性)鏈接:DNA雙鏈上相鄰的3’羥基和5’磷酸基團(tuán)共價結(jié)合形成3’5’磷酸二酯鍵,使原來斷開的DNA缺口重新連接起來。(載
9、體片段和基因片段,緩沖液,連接酶;1626℃,數(shù)小時;70℃加熱10min終止反應(yīng))轉(zhuǎn)化:把外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞的過程。(氯化鈣法向大腸桿菌導(dǎo)入外源基因)2.目標(biāo)基因克隆的主要方法有哪些?分析其特點(diǎn)及其適用范基因克隆的主要方法有哪些?分析其特點(diǎn)及其適用范圍①PCR擴(kuò)增。優(yōu)點(diǎn):簡便快速,高效,數(shù)kb單基因克隆。缺點(diǎn):DNA聚合酶活性和保真性限制。(94℃變性→55℃退火→72℃延伸→94℃變性……)②文庫篩選。優(yōu)點(diǎn):長片段,無堿基錯誤,位
10、置序列基因克隆。缺點(diǎn):繁瑣,過程復(fù)雜,耗時,昂貴。③化學(xué)合成:簡便,準(zhǔn)確,已知序列基因克隆,引物合成。缺點(diǎn):受合成儀性能限制,長度很短。3.大腸桿菌中高效表達(dá)蛋白桿菌中高效表達(dá)蛋白藥物著重物著重設(shè)計設(shè)計哪幾個方面?哪幾個方面?為了確保工程菌構(gòu)建的有效性,必須遵循GMP及其有關(guān)生物制品研究技術(shù)指導(dǎo)原則,做好菌種的記錄和管理。①表達(dá)載體,詳細(xì)記錄表達(dá)載體,包括基因的來源、克隆和鑒定,表達(dá)載體的構(gòu)建、結(jié)構(gòu)和遺傳特性。②宿主細(xì)胞:詳細(xì)記錄宿主細(xì)
11、胞的資料,包括細(xì)胞株系名稱、來源、傳代歷史、鑒定結(jié)果及基本生物學(xué)特性等。③目標(biāo)基因序列:目標(biāo)基因的序列包括插入基因和表達(dá)載體兩端控制區(qū)的核苷酸序列,以及所有與表達(dá)有關(guān)的序列,做到序列清楚。重組人干人干擾素生素生產(chǎn)工藝1.重組人干人干擾素生素生產(chǎn)工藝路線有哪幾條,有何缺點(diǎn)?有哪幾條,有何缺點(diǎn)?①體外誘生干擾素制備工藝:仙臺病毒誘導(dǎo)人白細(xì)胞:血漿→人白細(xì)胞(病毒誘導(dǎo))→分離純化→人白干擾素。缺點(diǎn):產(chǎn)量低,1gIFNα需要105L人血白細(xì)胞,
12、來源困難,工藝復(fù)雜,收率低,價格昂貴,潛在的血源性病毒污染的可能性。②Namalva細(xì)胞培養(yǎng)(病毒培養(yǎng))→合成干擾素→分離純化→多壓型混合干擾素。優(yōu)點(diǎn):首次實(shí)現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn),用細(xì)胞培養(yǎng)8000L。缺點(diǎn):活性低,退出臨床應(yīng)用。③工程菌構(gòu)建→發(fā)酵培養(yǎng)→包涵體→復(fù)性→重組人干擾素。工藝特點(diǎn):發(fā)酵過程,隨后變性、復(fù)性過程。缺點(diǎn):生物合成、純化及制劑階段均使用了一些動物或人血液提取成分,仍然沒有擺脫潛在的傳播血源性疾病的危險。④工程CHO細(xì)胞
13、系構(gòu)建→細(xì)胞培養(yǎng)→收集培養(yǎng)液→分離純化→重組人干擾素。工藝特點(diǎn):分泌表達(dá),產(chǎn)量低,成本高,過程控制嚴(yán)格??梢宰龅綗o血清培養(yǎng)。⑤基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝。工藝特點(diǎn):發(fā)酵周期短:幾個小時,無需變性、復(fù)性過程,獲得有活性產(chǎn)品,純化過程:淘汰抗體親和層析,制劑中采用非人血清白蛋白新型保護(hù)劑,使得整個制造過程中不使用任何血液提取成分。2.重組人干人干擾素發(fā)酵工段的關(guān)酵工段的關(guān)鍵控制點(diǎn)是什么,如何控制點(diǎn)是什么,如何實(shí)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)最優(yōu)化過程控制?程控
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