生物檢測技術(shù)

1、,生物技術(shù)與食品安全和品質(zhì)控制,,第1節(jié) 生物傳感器及其在食品檢測中的應(yīng)用第2節(jié) 免疫學(xué)技術(shù)與食品安全檢測第3節(jié) 分子生物學(xué)技術(shù)及其在食品安全檢測中的應(yīng)用第4節(jié) 生物芯片及其食品安全檢測中的應(yīng)用,,一、生物傳感器的基本概念（一）生物傳感器的定義 傳感器 一種把一種信號轉(zhuǎn)換成另一種信號以實現(xiàn)信號檢測的元器件.由固定化的具有分子識別功能的生物材料、換能器和信號處理放大裝置組成的分析工具或系統(tǒng)。 被轉(zhuǎn)換的信號通常包括

2、磁、力、熱、光、電、化學(xué)，這些信號可以轉(zhuǎn)換成聲、光、電等信號以便分析和檢測。,第1節(jié) 生物傳感器及其在食品檢測中的應(yīng)用,,從傳感器對不同能量進行變換的功能分類：光（輻射）傳感器磁傳感器力（壓力和加速度）傳感器溫度傳感器化學(xué)傳感器,,物理傳感器,,生物傳感器（biosensor）以傳感器為基礎(chǔ)，由生物學(xué)、電化學(xué)、光學(xué)、熱力學(xué)及計算機等學(xué)科相互滲透和融合的產(chǎn)物，是多學(xué)科的交叉領(lǐng)域。屬于化學(xué)傳感器的范圍,,生物傳感器的基本組成單

3、位：生物敏感元件/生物識別元件(biological sensing element) 是酶、抗原（體）和微生物細胞等具有分子識別能力的生物分子經(jīng)固定化后形成的一種膜結(jié)構(gòu)，對被測定的物質(zhì)有選擇性的分子識別能力,,換能器/轉(zhuǎn)換器（transducer） 能將識別元件上進行的生化反應(yīng)中消耗或生成的化學(xué)物質(zhì)，或產(chǎn)生的光或熱等轉(zhuǎn)換為電信號，并且在一定條件下，產(chǎn)生的電信號強度和反應(yīng)中物質(zhì)的變化量呈現(xiàn)一定的比例關(guān)系,,信號處理放大

4、裝置（singal ampligication system） 能將換能器產(chǎn)生的電信號進行處理、放大和輸出。,,（二）生物傳感器的基本組成和分類1 生物傳感器的基本組成,,,,,被測物,,,,生物識別元件 換能器,,,識別部位,,,電信號,,信號處理裝置,2 生物傳感器的分類,酶傳感器 微生物傳感器 免疫傳感器 細胞器傳感器

5、 細胞傳感器 組織傳感器 DNA傳感器,生物敏感材料,,電化學(xué)生物傳感器 介體生物傳感器 測光型生物傳感器 測熱型生物傳感器 半導(dǎo)體生物傳感器 壓電晶體生物傳感器,換能器不同,,,,二 生物傳感器的基本原理（一）生物傳感器的反

6、應(yīng)基礎(chǔ)及分子識別機理 生物敏感材料中生物分子能選擇性的和待測樣品中的待測成分進行特異性結(jié)合的性質(zhì) 包括酶、抗原、微生物細胞、組織切片、DNA等,,通過生物的分子識別作用，生物傳感器中的生物敏感材料和生物樣品中的待測物質(zhì)特異性結(jié)合，并進行生物化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生離子、質(zhì)子和質(zhì)量變化等信號，信號的大小在一定條件下和樣品中被測物質(zhì)的量存在一定的關(guān)系，這些信號經(jīng)換能器轉(zhuǎn)換成電信號，電信號再經(jīng)信號分析處理系統(tǒng)處理后輸出，反映出樣品中被測

7、物質(zhì)的量。,生物傳感器模型,,生物傳感器原理圖,,分子識別（molecular recognition） 指生物敏感材料中生物分子能選擇性地和待測樣品中的待測成分進行特異性（選擇性）結(jié)合的性質(zhì)。生物敏感材料包括酶、抗原（體）等免疫物質(zhì)、微生物細胞和DNA等。,,酶的分子識別:指酶分子只能和特定的底物分子進行結(jié)合，而不能和其他分子結(jié)合的特性。酶分子的識別能力主要是由酶的活性中心決定，其決定了以酶為生物敏感材料的生物傳

8、感器的分子識別能力。 免疫傳感器的分子識別：由傳感器上的生物敏感材料－抗原或抗體物質(zhì)的分子識別能力決定，抗原和抗體象酶和底物一樣也能發(fā)生特異性（選擇性）結(jié)合。 DNA傳感器的分子識別：由DNA分子中堿基對的互補結(jié)合特性決定。,,1 酶促反應(yīng)E+S→ES →P+EE:酶S:底物ES:中間絡(luò)合物P:反應(yīng)產(chǎn)物,,免疫化學(xué)反應(yīng)Ag+Ab=AgAbAg：抗原Ab：抗體,,3 微生

9、物反應(yīng) 利用微生物作為天然的生物催化劑進行的反應(yīng)。 微生物細胞是一個極其復(fù)雜的、完整的生命系統(tǒng)，數(shù)以千計的酶在系統(tǒng)中高度協(xié)調(diào)地行使其功能。,,微生物細胞的膜系統(tǒng)為酶反應(yīng)提供了天然的適宜環(huán)境，細胞可以在相當(dāng)長的時間內(nèi)保持一定的催化活性在多底物反應(yīng)時，微生物比單純酶更適宜作催化劑細胞本身能提供酶促反應(yīng)所埯的各種輔酶和輔基微生物細胞比酶的來源更方便，價格低,,生物學(xué)反應(yīng)中的物理量變化熱焓變化生物發(fā)光顏色反應(yīng)阻抗變

10、化直接產(chǎn)生電信號,（四）生物傳感器的特點,(1)根據(jù)生物反應(yīng)的特異性和多樣性,理論上可以制成測定所有生物物質(zhì)的傳感器,因而測定范圍廣泛。(2)一般不需進行樣品的預(yù)處理,它利用本身具備的優(yōu)異選擇性把樣品中被測組分的分離和檢測統(tǒng)一為一體，測定時一般不需另加其他試劑,使測定過程簡便迅速,容易實現(xiàn)自動分析。(3)體積小、響應(yīng)快、樣品用量少,可以實現(xiàn)連續(xù)在位檢測。,,(4)通常其敏感材料是固定化生物元件,可反復(fù)多次使用(5)準(zhǔn)確度高,一般

11、相對誤差可達到1%以內(nèi)(6)可進行活體分析(7)傳感器連同測定儀的成本遠低于大型的分析儀,因而便于推廣普及(8)有的微生物傳感器能可靠地指示微生物培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的供氧狀況和副產(chǎn)物的產(chǎn)生，能得到許多復(fù)雜的物理化學(xué)傳感器綜合作用才能獲得的信息。,,三、生物傳感器在食品工業(yè)中的應(yīng)用（一）農(nóng)藥和抗生素殘留的分析乙酰膽堿酯場效應(yīng)管傳感器，用于分析敵敵畏等有機磷農(nóng)藥的殘留乙酰膽堿酯酶能催化乙酰膽堿水解成膽堿和乙酸，當(dāng)存在有機磷農(nóng)藥殘留時，能

12、夠抑制乙酰膽堿酯酶的活性，使膽堿和乙酸的產(chǎn)生減少，且在一定條件下，乙酸的減少量和有機磷農(nóng)藥的量之間存在一定的比例關(guān)系， 乙酸的減少量可以通過離子場效應(yīng)管來測定,,,（二）抗生素殘留的分析 青霉素和磺胺是獸藥中常用的抗生素，其殘留會污染動物性食品，從而對人類的健康造成危害。 采用免疫傳感器測定了牛奶中硫胺二甲嘧啶的含量，靈敏度達到1ng／g，傳感器表面經(jīng)NaOH和HCl處理后可以重復(fù)使用。 用抗體酶共軛物為

13、敏感材料結(jié)合光度分析法檢測了牛奶中青霉素的含量。,,（三）食品添加劑的分析 亞硫酸鹽是常用的食品防腐劑和漂白劑，但是亞硫酸鹽容易引起哮喘，美國FDA規(guī)定了其在新鮮水果和蔬菜等食品中的含量不得超過1×10-6mol／L。 天冬酰苯丙氨酸甲酯，又稱甜味素，是人工合成的低熱量甜味劑。 煙堿酸屬于B族維生素，可以作為肉類食品的發(fā)色劑，但是人體攝入過量的煙堿酸會引起瘙癢和頭痛等中毒癥狀，在日本已禁止使

14、用。 其他食品添加劑，如防腐劑苯甲酸鈉、羥基苯甲酸鈉、過氧化氫，抗氧化劑抗壞血酸、脫氫抗壞血酸、兒茶酚、兒茶酚胺，發(fā)色劑亞硝酸，酸味劑磷酸和乳酸等都可以用相應(yīng)的生物傳感器來檢測它們在食品中的含量。,,（四）污染微生物的檢測利用微生物在代謝過程中產(chǎn)生電子，電子直接在陽極上放電產(chǎn)生電流，通過測定電流大小從而測定微生物濃度的傳感器檢測釀酒酵母、乳酸菌病原菌,,污染食品的微生物可以分為腐敗菌和病原菌。腐敗菌主要是通過對食品

15、成分的分解和破壞，同時產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)從而對人體造成危害。腐敗菌本身通常不是致病菌。病原菌除了能破壞食品的組成成分外，其菌體本身也能使人致病。 食品中污染微生物的檢測方法通常是平板計數(shù)法，其操作繁瑣，檢測時間長，特別是對于病原菌的檢測，有時長達l-2周才能出結(jié)果，因此各種快速檢測方法不斷涌現(xiàn)，生物傳感器檢測方法就是其中的一種。,,1.腐敗菌的檢測 釀酒酵母、乳酸菌和枯草芽孢桿菌等是常見的食品腐敗菌。 2.病原菌的

16、檢測 常見的污染食品的病原菌有沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和蠟樣芽孢桿菌等。這些病原菌按常規(guī)的檢測方法檢測時間很長，而采用生物傳感器則能迅速地測定它們的數(shù)量。 用來測定病原菌的生物傳感器主要是光纖生物傳感器、免疫生物傳感器和DNA生物傳感器。 目前，上述病原菌都可以用相應(yīng)的生物傳感器來測定。,,（五）生物毒素的檢測細菌毒素:由細胞分泌產(chǎn)生于細胞外或存在于細胞內(nèi)的致病性物

17、質(zhì)真菌毒素：真菌分泌產(chǎn)生的有毒次生代謝產(chǎn)物,,污染食品的生物毒素主要包括細菌毒素、真菌毒素、藻類毒素以及動植物毒素，其中以細菌毒素和真菌毒素最為常見。 檢測毒素的方法包括色譜法（氣相色譜、液相色譜、薄層層析等）和生物學(xué)方法等，這些方法檢測時間長，對樣品的前處理復(fù)雜繁瑣。以免疫學(xué)方法和生物傳感器檢測方法為代表的各種快速方法備受歡迎。,,,（六）食品新鮮度的分析利用魚死亡后，魚肉中ATP分解代謝后各種代謝產(chǎn)物之間的

18、比例關(guān)系做成生物傳感器肉鮮度傳感器：單胺氧化酶固定于氧電極牛乳鮮度傳感器：牛乳中的微生物數(shù)量，乳酸增加量，或牛乳中的脂肪分解成的短脂肪酸的量來評價,,,第2節(jié) 免疫學(xué)技術(shù)與食品安全檢測,,一、常用的免疫學(xué)方法 以抗原抗體特異性結(jié)合為基礎(chǔ)發(fā)展起來的，這種特異結(jié)合可以發(fā)生在生物體內(nèi)也可以發(fā)生在體外，用于食品衛(wèi)生和安全檢測的都是體外反應(yīng)，必須使用含有特異性抗體的血清，又稱為血清學(xué)反應(yīng)或血清學(xué)方法。,,根據(jù)給出的檢測結(jié)果是定性的還

19、是定量的，免疫學(xué)方法（血清學(xué)方法）可以分為定性免疫學(xué)方法和定量免疫學(xué)方法。 定性免疫學(xué)方法：能給出分析樣品中是否含有某種特定的抗原或抗體，或者特定抗原或抗體的含量是否高于或低于某一數(shù)值。 定量免疫學(xué)方法：能給出樣品中特定的抗原或抗體的準(zhǔn)確數(shù)量。,,,（一）酶免疫分析（EIA）抗原（抗體）被酶標(biāo)記后與相應(yīng)的抗體（抗原）反應(yīng)，通過測定酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物量來計算抗原抗體的結(jié)合量，進而計算出待檢測物質(zhì)（抗原或抗體）量的方

20、法。,,（二）酶聯(lián)免疫吸附方法（ELISA） 酶標(biāo)板為載體，在適當(dāng)條件下使抗原或抗體上包被或吸附在酶標(biāo)記板微孔的內(nèi)壁上成為固相抗原或抗體，沒有被吸附的被洗滌除去，然后加入酶標(biāo)記抗體或抗原形成酶標(biāo)記的抗得抗體復(fù)合物固定在微孔或試管上,,（三）免疫沉淀反應(yīng) 將可溶抗原與相應(yīng)抗體在適量的電解質(zhì)存在的條件下發(fā)生特異性結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物并出現(xiàn)肉眼可見的沉淀 ，這種沉淀只有在抗原抗體比例適合時才能形成。,,（四）免疫凝集反應(yīng)

21、 顆粒抗原（細菌、血紅細胞）或可溶性抗原（抗體）結(jié)合于不溶性的載體微粒上后與相應(yīng)的抗體（抗原）在適當(dāng)?shù)臈l件下，經(jīng)一定時間后凝集成肉眼可見的凝聚物的反應(yīng),,,二、免疫技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用（一）在食品污染細菌及其毒素檢測方面沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、氣單胞菌、霍亂弧菌,,（二）食品中污染真菌及其毒素的免疫分析地菌屬、根霉屬、青霉屬、曲霉屬、毛霉屬、分枝霉屬、腐質(zhì)霉屬等,（三）食品中農(nóng)藥殘留的免疫學(xué)方法檢測,,食品

22、中的農(nóng)藥殘留包括除草劑殘留、有機磷、有機氯和氨基甲酸酯類等殺蟲劑的殘留。目前農(nóng)藥殘留的檢測手段主要是毛細管氣相色譜和高效液相色譜及其聯(lián)用技術(shù)。 免疫學(xué)方法用于食品中農(nóng)藥殘留檢測和分析的研究大約開始于十多年前。由于具有快速、靈敏、特異、操作簡便、無須昂貴的儀器設(shè)備和可以在采樣現(xiàn)場分析等優(yōu)點，已成為當(dāng)今農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)的主要發(fā)展方向之一，越來越受到人們的重視。,,（四）食品中抗生素殘留的免疫檢測農(nóng)用抗生素、畜用抗生素,,（

23、五）食品中摻假物的免疫學(xué)識別綿羊奶或山羊奶奶酪的生產(chǎn)中，摻雜有牛奶成分將影響綿羊（山羊）奶奶酪的品質(zhì)和加工特性，因此在加工過程中應(yīng)避免牛奶的摻入。,,（六）免疫學(xué)方法在分析樣品凈化中的應(yīng)用抗黃曲霉毒素、伏馬素等的抗體包被在葡萄糖凝膠或瓊脂凝膠顆粒上，形成免疫親和層析柱,第3節(jié) 分子生物學(xué)技術(shù)及其在 食品安全檢測中的應(yīng)用,（一）分子雜交技術(shù),核酸的分子雜交,液相雜交,固相雜交,原位雜交,膜雜交,斑點印跡雜交Sout

24、her雜交Northern雜交,,,,,,,,,膜雜交：,,(二)PCR技術(shù) 不對稱PCR兩引物濃度不同，經(jīng)過若于輪循環(huán)，低濃度的引物被用盡，產(chǎn)生大量由高濃度引物引導(dǎo)產(chǎn)生的單鏈DNA，可以作為探針或DNA測序的核酸,,多重PCR同一反應(yīng)中采用多對引物對基因的不同片段同時擴增，可以同時擴增多個DNA片段,,巢式PCR采用兩對引物，一對在DNA外側(cè)，為外引物，另一對在內(nèi)側(cè)，稱為內(nèi)引物，實現(xiàn)對模板DNA含量很少的樣品的分析和檢

25、測,,,,,,外引物,外引物,內(nèi)引物,內(nèi)引物,,錨定PCR只知道DNA片段一端的序列在基因未知端添加已知的PolyA尾，人為的賦予基因未知末端特定的序列,,（三）在食品安全檢測中的應(yīng)用樣品前處理 靶微生物的富集：培養(yǎng)增殖法采用特定的選擇性培養(yǎng)基通過培養(yǎng)增殖的方式來提高樣品中的靶微生物數(shù)量，還可以降低樣品中PCR抑制劑的濃度以利于靶DNA的PCR擴增,PCR抑制劑的去除：,靶微生物的富集培養(yǎng)、凝膠過濾 土壤樣品

26、中微量的腐殖酸對PCR的抑制采用凝膠過濾,,2 食品中污染微生物的分子生物學(xué)技術(shù)檢測細菌：親水氣單胞菌、肉毒梭菌=腸道 致病性大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌病毒：輪狀病毒、肝炎病毒、腸病毒寄生蟲、隱孢球蟲、內(nèi)阿米巴蟲、梨形鞭毛蟲,,第四節(jié) 生物芯片及其在食品安全檢測 中的應(yīng)用,,（一）生物芯片按預(yù)先的設(shè)置排列固定有大量生物識別分子（例如DNA片段、RNA片段、抗原抗體分子或蛋白質(zhì)、肽分子）的

27、面積很小的載體（硅片、載玻片等）將待測樣品加在芯片表面，由于生物分子牧民性親和反應(yīng)，檢測樣品中的待檢測成分分別和芯片上固定化的生物識別分子結(jié)合反應(yīng)，從而實現(xiàn)對樣品的分析和檢測,,分類：DNA芯片、蛋白質(zhì)（肽）芯片,,DNA芯片的制備方法：1、芯片制備目前制備芯片主要以玻璃片或硅片為載體，采用原位合成和微矩陣的方法將寡核苷酸片段或cDNA作為探針按順序排列在載體上。芯片的制備除了用到微加工工藝外，還需要使用機器人技術(shù)。以便能快速、

28、準(zhǔn)確地將探針放置到芯片上的指定位置。,,2、樣品制備生物樣品往往是復(fù)雜的生物分子混合體，除少數(shù)特殊樣品外，一般不能直接與芯片反應(yīng)，有時樣品的量很小。所以，必須將樣品進行提取、擴增，獲取其中的蛋白質(zhì)或DNA、RNA，然后用熒光標(biāo)記，以提高檢測的靈敏度和使用者的安全性。,,3、雜交反應(yīng)雜交反應(yīng)是熒光標(biāo)記的樣品與芯片上的探針進行的反應(yīng)產(chǎn)生一系列信息的過程。選擇合適的反應(yīng)條件能使生物分子間反應(yīng)處于最佳狀況中，減少生物分子之間的錯配率。,,4

29、、信號檢測和結(jié)果分析雜交反應(yīng)后的芯片上各個反應(yīng)點的熒光位置、熒光強弱經(jīng)過芯片掃描儀和相關(guān)軟件可以分析圖像，將熒光轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)，即可以獲得有關(guān)生物信息。 基因芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標(biāo)是將從樣品制備、雜交反應(yīng)到信號檢測的整個分析過程集成化以獲得微型全分析系統(tǒng),,（二）、生物芯片的應(yīng)用1、DNA芯片應(yīng)用 DNA序列測定將未知序列的單鏈DNA片段和DNA芯片進行雜交，互補序列形成雙鏈，通過分析鑒定雙鏈體的情況可以得出未知DNA的序列,,

30、DNA多態(tài)性的分析檢測生物群體中，個體間基因核酸序列的差異。采用等位基因特異性的DNA探針固定在玻璃片上形成DNA芯片，采用PCR技術(shù)擴增待檢測的基因組的DNA，得到熒光樗的單鏈DNA片段，將其與DNA芯片雜交，最后得到多態(tài)性的分析,,DNA突變檢測表達分析,,2、蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用2000年9月，《science》，蛋白質(zhì)芯片研究蛋白質(zhì)之間以及蛋白質(zhì)與小分子之間的相互作用。用于制備無煙煤各種蛋白質(zhì)溶液中加入甘油，以防止蛋白變性

31、，將蛋白質(zhì)直接點接于載體膜上并固定化，之后以牛血清白蛋白進行封閉，降低膜上的背景，即得到蛋白質(zhì)芯片。,,2001年，《science》，將釀酒酵母5800個基因克隆并表達產(chǎn)生對應(yīng)的蛋白質(zhì)，分離純化這些蛋白質(zhì)，將它們固定于載體膜上得到蛋白質(zhì)芯片應(yīng)用時將其他蛋白質(zhì)或小分子物質(zhì)與芯片進行反應(yīng)，可以分析蛋白質(zhì)之間或蛋白質(zhì)與小分子之間的相互作用。,,3、生物芯片在食品安全檢測中應(yīng)用的前景食品中毒事件的調(diào)查食品污染生物毒素的檢測食品中污染病