蠶豆病實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1、臨床十二大班9人組,2012級(jí)本科分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),,,案例,患兒，男性，3歲，因面色蒼白伴血尿1天入院。1天前食用新鮮蠶豆后，今日出現(xiàn)惡心、嘔吐、排尿呈醬油樣色，面色蒼白。據(jù)家長(zhǎng)反映，患者的姐姐也曾發(fā)生過類似情況。體格檢查：體溫38℃，脈搏150次/分，呼吸40次/分，血壓80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色蒼白，皮膚及鞏膜黃染，體型較同齡人瘦小。心、肺未及異常，肝、脾未觸及，雙腎區(qū)無叩擊痛，神經(jīng)系統(tǒng)檢查未及異常。實(shí)驗(yàn)

2、室檢查：紅細(xì)胞 1.98×1012/L，血紅蛋白53g/L，血清總膽紅素85.5µmol/L，結(jié)合膽紅素13.7µmol/L，未結(jié)合膽紅素71.8µmol/L，尿蛋白（++），潛血(+)，尿膽紅素(－)，尿膽素原(+)，尿液鏡下未見紅細(xì)胞。,案例分析,1、惡心、嘔吐、排尿呈醬油樣色，臉色蒼白， 皮膚及鞏膜黃染（伴有溶血性黃疸）2、心、肺未及異常，肝、脾未觸及，雙腎區(qū)無叩擊痛，神

3、經(jīng)系統(tǒng)檢查未及異常（癥狀不嚴(yán)重）,案例分析,3、血象 紅細(xì)胞 1.98×1012/L（↓）﹤4.0～5.5﹥×1012/L 血紅蛋白53g/L（↓） （110-150G/L ） 血清總膽紅素85.5µmol/L（↑）1.71-17.1μmol/L4、尿常規(guī) 尿液下未見紅細(xì)胞（紅細(xì)胞膜已不完整） 尿膽素原呈陽(yáng)性,輕度蠶豆病并伴溶血性黃疸,,根據(jù)以上信息和檢查診斷,蠶豆病

4、簡(jiǎn)介,蠶豆病是一種6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G-6-PD）缺乏所導(dǎo)致的疾病，表現(xiàn)為在遺傳性葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PD）缺陷的情況下，食用新鮮蠶豆后突然發(fā)生的急性血管內(nèi)溶血。 多見于兒童，男性患者約占90%以上。,臨床表現(xiàn),早期有惡寒、微熱、頭昏、倦怠無力、食欲缺乏、腹痛，繼之出現(xiàn)黃疸、貧血、血紅蛋白尿，尿呈醬油色，此后體溫升高，倦怠乏力加重，可持續(xù)3日左右。與溶血性貧血出現(xiàn)的同時(shí)，出現(xiàn)嘔吐、腹瀉和腹痛加劇，肝臟腫大，肝功能異常，

5、約50%患者脾大。嚴(yán)重病例可見昏迷、驚厥和急性腎衰竭，若急救不及時(shí)常于1～2日內(nèi)死亡。,紅細(xì)胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性測(cè)定（紫外法）,設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確診斷,實(shí)驗(yàn)原理,,●要檢測(cè)G6PD的活性，可以檢測(cè)NADPH生成量,實(shí)驗(yàn)原理,●已知：NADPH在340nm的紫外線照射下產(chǎn)生熒光即可以每隔2分鐘在340nm波長(zhǎng)下測(cè)定孵育液中NADPH吸光度以10min吸光度值的變化（△A340）計(jì)算NADPH的產(chǎn)量。,實(shí)驗(yàn)原理,還原型谷胱甘肽使

6、高鐵血紅蛋白還原為血紅蛋白,2G-SH,,,,,,,MHb Hb,G-S-S-G,NADP+ NADPH,●即可以檢測(cè)血紅蛋白的含量,實(shí)驗(yàn)器材和試劑,1.實(shí)驗(yàn)器材 恒溫水循環(huán)紫外分光光度計(jì)，可見分光光度計(jì)，離心機(jī)。2.試劑（1）0.5mol/L Tris-HCl MgCl2緩沖溶液（pH8.0）：稱取Tris12.1g,MgCl2·6H2O 4.0

7、6g,加入160mL蒸餾水溶解，用HCl調(diào)pH至8.0，然后加入蒸餾水至200mL。（2）2 mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP＋)：稱取NADP＋ 21.3mg，溶于10mL蒸餾水中。4 ℃可保存20天左右。,（3）6mmol/L葡萄糖—6—磷酸二鈉(G6P－Na2)：稱取21.5mg G6P－Na2·2H2O，溶于10mL蒸餾水中。4 ℃可保存20天左右。（4）溶血?jiǎng)喝€基乙醇0.1mL，10% EDTA

8、 2.0mL，6mmol/L NADP＋ 0.4mL，加蒸餾水至總體積200mL。（5）血紅蛋白氧化劑（Drabkin試劑）：稱取K3Fe(CN)6 0.2g，KCN 0.052g，NaHCO3 1.0g，加蒸餾水至1000mL，置棕色瓶?jī)?nèi)避光保存，可保存20天。（6）0.9% NaCl，ACD抗凝劑。,實(shí)驗(yàn)器材和試劑,實(shí)驗(yàn)操作流程,1、洗滌紅細(xì)胞 取靜脈血2.0mL，放入含0.4mLACD抗凝劑的試管中，混勻。吸取0.

9、2mL抗凝血放入試管中，加入4mL預(yù)冷的生理鹽水，輕輕搖勻，2500r/min離心5min,傾去上清，重復(fù)三次。2、溶血液的制備 向紅細(xì)胞沉淀中加入溶血?jiǎng)?.0mL，震蕩1min，4℃放置10min以上。,3、NADPH的測(cè)定 取石英比色杯兩只，標(biāo)為“測(cè)定”及“空白”，按下表操作：,,,,試劑,體積,蒸餾水（uL）0.5mol/L Tris-HCl MgCl2緩沖溶液（uL）6mmol/L G6P-Na2 (uL)2

10、mmol/L NADP+ (uL),2040300300300,混勻后放入帶恒溫水循環(huán)（25℃）的紫外分光 光度計(jì)中，預(yù)熱10min然后在“測(cè)定”中加入溶血液60uL,“空白”中加入溶血?jiǎng)?0uL，混勻,以“空白”調(diào)“0”,1min后開始測(cè)340nm吸光度（A340），每2min紀(jì)錄吸光度一次，至10min止，比較每2minA值的變化情況，若相近則表明酶促反應(yīng)平穩(wěn)。以10minA值的變化（△A340）計(jì)算NADPH

11、的產(chǎn)量。,4.溶血液中血紅蛋白含量的測(cè)定 取試管一支，按下表操作：,,,,試劑,體積,Drabkin(mL)溶血液(mL),0.33.0,混勻，室溫放置15min，以Drabkin試劑調(diào)零，讀取540nm的吸光度（A540）。,注意事項(xiàng),1.洗滌紅細(xì)胞時(shí)禁止劇烈震蕩，避免溶血。2.測(cè)定NADPH時(shí)讀取吸光度的時(shí)間要準(zhǔn)確。,結(jié)果分析,1.NADPH產(chǎn)量的計(jì)算 NADPH在340nm處，其每微摩爾的吸光系數(shù)（ε）為6.220，故

12、10min內(nèi)NADPH的產(chǎn)量計(jì)算公式為：NADPH產(chǎn)量（μmol） =2.血紅蛋白含量的計(jì)算 血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白以后，在540nm處，其毫摩爾吸光細(xì)數(shù)（ε）為44，故溶血液中血紅蛋白的含量計(jì)算公式為：血紅蛋白含量（mmol）=,3.G6PD比活性（U/g Hb）的計(jì)算G6PD比活性單位（U/g Hb）==,【參考范圍】正常值：大于2.8U/gHb,從生化代謝解釋患兒的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果,生化角

13、度,實(shí)驗(yàn)室檢查,,結(jié)果導(dǎo)致,紅細(xì)胞膜的破壞膽色素代謝異常,G6PD,磷酸戊糖途徑,,NADPH,磷酸戊糖,,,維持谷胱甘肽的還原性,核酸生物合成原料,紅細(xì)胞膜的破壞,谷胱甘肽阻止氧化血紅蛋白，從而保護(hù)紅細(xì)胞膜的完整性，如若缺乏，此時(shí)的紅細(xì)胞易于破裂 。,NADPH—高鐵血紅蛋白還原酶,GSH,MHb,Hb,,紅細(xì)胞膜的破壞,,膽紅素,鐵卟啉類化合物的降解產(chǎn)物80%以上來自衰老紅細(xì)胞破壞所釋放的血紅蛋白的分解自由通過生物膜產(chǎn)生毒性作

14、用,G6PD缺乏,,NADPH嚴(yán)重缺乏,,,谷胱甘肽難以保持還原狀態(tài),NADPH—高鐵血紅蛋白還原酶活性低,紅細(xì)胞膜完整性破壞,紅細(xì)胞裂解,血紅蛋白大量溢出,膽紅素生成量增加,,Hb大量氧化成MHb，Hb含量減少,,,,,,具體分析,皮膚及粘膜黃染 血清總膽紅素超過17μmol/L即為高膽紅素血，一般若在17～34μmol/L，臨床無明顯黃疸，為隱性黃疸，超過34μmol/L則可見皮膚、粘膜黃染。血尿 急性溶血時(shí)大量紅細(xì)

15、胞被破壞，其成分從尿液中排除故出現(xiàn)血尿。,具體分析,體溫升高 大量溶血，即血紅細(xì)胞大量破壞，大量的無菌性壞死物質(zhì)入血，機(jī)體動(dòng)員白細(xì)胞吞噬吸收壞死物質(zhì)，導(dǎo)致無菌性炎癥，可引起發(fā)熱，亦稱為吸收熱。 呼吸加快及心律升高 由于急性溶血導(dǎo)致循環(huán)血量減少，紅細(xì)胞減少， 血紅蛋白減少，氧氣供應(yīng)相對(duì)不足，故機(jī)體通過加快呼吸頻率，以及加快心率維持心輸出量的相對(duì)穩(wěn)定以維持機(jī)體代謝的供氧。,患者體型瘦小與該病癥是否有關(guān)，為什么？

16、（選答）,患者體型瘦小與該病癥有關(guān),蠶豆病是因?yàn)轶w內(nèi)缺乏G6PD， G6PD主要影響體內(nèi)的磷酸戊糖途徑 該途徑主要生成兩種重要的物質(zhì)即5-磷酸核糖和NADPH,5-磷酸核糖影響：,1：核酸的合成 2：體內(nèi)己糖和戊糖的代謝 3：3—7碳原子糖類物質(zhì)的相互轉(zhuǎn)化,G6PD,NADPH影響：,1：體內(nèi)以NADPH作為供氫體合成多種活性物質(zhì)如膽固醇 脂肪酸 和一些非必需氨基酸2： NADPH可作為羥化酶的輔酶，參與體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化作用3：

17、NADPH參與吞噬細(xì)胞的殺菌作用4：維持GSH的正常水平 GSH可以保護(hù)體內(nèi)蛋白質(zhì)或酶免遭氧化 使蛋白質(zhì)或酶處于活性狀態(tài),磷酸戊糖途徑中生成多余的核糖轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛進(jìn)入糖酵解途徑，G6PD缺乏使得糖代謝受到影響。脂酸可以合成甘油三酯，其主要功能是儲(chǔ)存和氧化能量，機(jī)體難以合成甘油三酯則消耗原有儲(chǔ)備的甘油三酯，使得機(jī)體消瘦。同時(shí)體內(nèi)的一些生物活性物質(zhì)功能發(fā)生障礙，如膽固醇不能直接氧化但能轉(zhuǎn)化為膽汁酸、類固醇激素 、維生

18、素D3，參與物質(zhì)代謝調(diào)節(jié)，膽汁酸具有促進(jìn)脂類消化和吸收的作用；維生素D3主要參與體內(nèi)血鈣和血磷的調(diào)節(jié)。生物轉(zhuǎn)化作用可以對(duì)體內(nèi)大部分非營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行代謝轉(zhuǎn)化，或使有毒物質(zhì)的毒性減低或消除，增強(qiáng)這些非營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的水溶性和極性，從而易于從膽汁或尿液中排除。 GSH可以保護(hù)體內(nèi)蛋白質(zhì)或酶免遭氧化 使蛋白質(zhì)或酶處于活性狀態(tài)，蛋白質(zhì)一方面可以作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供能量一方面又發(fā)揮著其它重要的生物功能，而酶使得生物體內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)有條不紊的進(jìn)行。,綜上所述：