[學(xué)習(xí)]定量pcr基本原理及方法

1、定量PCR基本原理及方法,基因有限公司 黃妤,熒光定量PCR基本原理熒光定量PCR標記方法熒光定量PCR不同方法學(xué)的應(yīng)用,內(nèi)容,,定量PCR技術(shù)的產(chǎn)生1992年由Higuchi等人第一次報告：使用EB加入PCR反應(yīng)體系，經(jīng)改裝的帶有冷CCD的PCR儀檢測樣品的熒光強度核酸 ? 染料熒光后來用與雙鏈DNA有更強結(jié)合力的SYBR Green I取代EB,熒光定量PCR基本原理,,Real-time Chemistries,PC

2、R的理論方程：Y=x×(1+ Ev)n Y：擴增物數(shù)量； X ：起始模板數(shù)量；Ev：擴增效率；n：擴增循環(huán)數(shù),1. 終點法定量原理前提：在最佳實驗、循環(huán)次數(shù)n一定、Ev相同原理：根據(jù)擴增產(chǎn)物的量計數(shù)反應(yīng)物中原始分子數(shù)，即：lnx=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY - b (b為常數(shù))2. 實時檢測法定量原理前提：在最佳實驗、相同Ev以、擴增產(chǎn)物量相同原理：反應(yīng)物中原始分子數(shù)（X）與其所需要的擴增

3、循環(huán)次數(shù)（n）成反比，由此計算出標本中靶分子的準確含量，即：LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b - n×a (a、b為常數(shù)),熒光定量PCR的定量原理,n: 擴增循環(huán)數(shù)的確定,logN=log N0 +nlogE n=Ct每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品作出標準曲線，根據(jù)未知樣品的Ct值，即可計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。,Ct值與起始模板的關(guān)系,

4、,Y軸—Ct值,X—起始拷貝數(shù)的對數(shù),,,標準曲線由系列稀釋的已知濃度的樣品做標準曲線計算待測樣品的初始模板濃度,log N0 =-Ct logE+logN,絕對定量——未知濃度的樣品與標準曲線相比較,內(nèi)摻式染料 SYBR Green I, LC Green 序列特異性探針 Taqman Molecular Bea

5、cons FRET 引物特異性探針Amplifluor (Intergen) LUX,熒光定量 PCR 標記方法,內(nèi)摻式染料 SYBR-Green I,內(nèi)摻式染料 SYBR-Green I,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,雙標記探針（Taqman Probe）

6、,X,,,分子信標（Molecular Beacon Probe）,Oligo 1: Fluorescein,Oligo 2: LC Red 640,,,,,熒光共振能量傳遞（FRET Probe）,熒光定量PCR不同方法學(xué)的應(yīng)用,研究目的 標記方法,定量分析（基因拷貝數(shù)的絕對定量，基因表達調(diào)控的相對定量） Sybr-Green (LC Green), Taqman, Molecular Beacon, etc,研究目的,基

7、因型分析（SNP、突變型分析） Taqman, Molecular Beacon, FRET, LC Green,熔解曲線分析 Sybr-Green, LC Green, Molecular Beacon, FRET,某科研用戶使用Rotor-Gene 3000進行基因表達檢測結(jié)果 （自備標準品，檢測樣品做復(fù)管）,,絕對定量,某科研用戶使用Rotor-Gene 3000進行基因表達相對定量分析，下圖為用??Ct法

8、得出的分析結(jié)果 。（自備標準品，檢測樣品做3次重復(fù)復(fù)管）,HouseKeeper Gene,Gene of Interest,相對定量,利用溶解曲線進行實驗條件的優(yōu)化（RG3000）,熔解曲線分析,Annealing at 60℃,Annealing at 63℃,標記方法,Taqman 定量分析，基因型分析,Sybr-Green 定量分析，熔解曲線分析，基因型分析 (LC Green),Molecular Beacon

9、 定量分析，熔解曲線分析，基因型分析,FRET 定量分析，熔解曲線分析，基因型分析,Ampliflour Probe，LUX 定量分析,基因型分析,利用擴增信號的種類來分型 —— Taqman根據(jù)熔解曲線的不同來分型 —— FRET, Molecular Beacon LC Green,,,,雙T

10、aqman探針法檢測野生型和突變型 在基因型分析中，可采用兩種不同的Taqman探針（分別針對野生型和突變型)，即一個突變型探針以一種熒光素（Flr）標記，而野生型探針則用不同的熒光物（Tet）標記。如果只有一種信號被擴增出來，則樣本為對應(yīng)的基因型（野生型或突變型）的純合子；如二者都被有效地擴增出來，則樣本為雜合型。,利用擴增信號的種類來分型,雜合型,野生型,突變型,,FRET探針進行熔解曲線分析確定基因型

11、 FRET探針與模板結(jié)合時，因共振能量的傳遞而信號增強，而當(dāng)在Tm 值時，F(xiàn)RET探針與PCR產(chǎn)物分開，熒光信號減弱。通過實時捕捉到的PCR產(chǎn)物在熔解過程中熒光信號的變化，得到PCR產(chǎn)物的熔解曲線。因為發(fā)生基因突變的PCR產(chǎn)物有特定的Tm 值，通過測定探針與PCR產(chǎn)物分開時的熔解溫度Tm值，就能確定樣品的基因型。,利用熔解曲線檢測基因突變,雜合型,野生型,突變型,利用內(nèi)摻式染料進行高分辨率熔解曲線（HRM）分析基因型HRM根據(jù)