好氧發(fā)酵產(chǎn)物積累機(jī)制

1、第六章 好氧發(fā)酵產(chǎn)物積累機(jī)制,好氧性發(fā)酵(aerobic fermentation)：在發(fā)酵過程中需要不斷地通入一定量的無菌空氣，如利用黑曲霉進(jìn)行檸檬酸的發(fā)酵、利用棒狀桿菌進(jìn)行谷氨酸的發(fā)酵、利用黃單孢菌進(jìn)黃原膠－多糖的發(fā)酵等等． 糖的分解代謝包括糖酵解（糖的共同分解途徑）和三羧酸環(huán)（糖的最后氧化途徑）。,在有氧條件條件下： 丙酮酸進(jìn)入線粒體，脫氫和脫羧生成乙酰COA，在TCA循環(huán)中脫氫，并氧化形成CO2和 H2O，

2、或者各種代謝物，NADH2經(jīng)呼吸鏈將氫傳遞給氧生成水。 另外，乙酰輔酶A在生物合成過程中作為C2化合物加以利用，形成脂肪等。,第一節(jié) 檸檬酸的發(fā)酵機(jī)制一、檸檬酸的合成途徑 黑曲霉 (Asp.niger)　　　 原料：sugar ， alcohol， acetic acid 途徑： EMP（HMP）

3、 丙酮酸羧化 TCA環(huán) 黑曲霉生長，EMP與HMP途徑的比率是2：1，生產(chǎn)檸檬酸時(shí)為4：1。 葡萄糖 檸檬酸(citric acid) 理論轉(zhuǎn)化率106.7%,,,R,,TCA循環(huán),,,檸檬酸的生物合成途徑,,,,,,1,2,

4、,二、 檸檬酸生物合成的代謝調(diào)節(jié),積累檸檬酸應(yīng)采取的措施：　想方設(shè)法提高檸檬酸合成反應(yīng)所需酶的活力；　必須切斷檸檬酸的去路；順烏頭酸酶失活，　　　　　　　　　　　　ＴＣＡ環(huán)阻斷?！”ＷC中間產(chǎn)物的供給；草酰乙酸的及時(shí)供給，　　　　　　丙酮酸　　　 二氧化碳固定反應(yīng)對檸檬酸　　

5、 積累有重要意義?！?CO2 　　 　　　　　　乙酰COA　草酰乙酸,,,1 糖酵解及丙酮酸代謝的調(diào)節(jié),第一個(gè)調(diào)節(jié)的酶是磷酸果糖激酶（PFK）：AMP、無機(jī)磷、NH4+對該酶有活化作用 ATP、檸檬酸對該酶有抑制作用 Q：PFK在正常生理?xiàng)l件下能被檸檬酸抑制，但在檸檬酸發(fā)酵中，檸檬酸濃度很高，為什么EMP途徑仍能保持暢通呢？,,,由于TCA循環(huán)降低，ATP的生成減少，蛋白質(zhì)和核酸合成受阻，細(xì)胞

6、內(nèi)的NH4+異常高，從而降低了檸檬酸對PFK的抑制。檸檬酸發(fā)酵需要下述環(huán)境條件： 磷酸鹽濃度低；氮源為NH4+鹽； pH值低（低于2.0）； 溶氧量高；Mn2+ 、 Fe2+ 、 Zn2+含量極低?！　幟仕岚l(fā)酵中黑曲霉對Mn2+極端敏感。黑曲霉在缺錳的條件下發(fā)酵 ，細(xì)胞有生理和代謝的變化?！　n2+的效應(yīng)可以認(rèn)為是NH4+水平升高而減弱了檸檬酸對EMP途徑關(guān)鍵酶（PFK）的抑制。,第二個(gè)調(diào)節(jié)的酶是丙酮酸激酶（

7、PK） 　 PK 被NH4+ 、K+激活磷酸烯醇丙酮酸－－－－丙酮酸＋ATP二氧化碳的固定反應(yīng) 參與二氧化碳固定反應(yīng)的酶：丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶,,2 　TCA環(huán)的調(diào)節(jié),檸檬酸合成酶是該途徑的第一個(gè)限速酶，由乙酰輔酶Ａ中的高能硫酯鍵水解釋放大量能量，推動(dòng)合成檸檬酸?！　幟仕帷　　№槥躅^酸　　　異檸檬酸 兩步反應(yīng)均由順烏頭酸酶催化，該酶需要Fe++， I 若用

8、絡(luò)合劑除去反應(yīng)液中的鐵，則酶活性被抑制，造成檸檬酸的積累。,,,II 阻斷順烏頭酸酶的催化作用：該酶是個(gè)含鐵的非血紅蛋白，以Fe4S4作為輔基。因此，在菌體生長到足夠菌數(shù)時(shí)，適量加入亞鐵氰化鉀（黃血鹽），使與鐵硫中心的Fe++ 生成絡(luò)合物，則該酶失活或活性減少，而積累檸檬酸。III 通過誘變或其他方法，造成生產(chǎn)菌種順烏頭酸酶的缺損或活力很低，同樣積累檸檬酸。 3 及時(shí)補(bǔ)加草酰乙酸　　 外加草酰乙酸　

9、 選育回補(bǔ)途徑旺盛的菌種。,,檸檬酸積累機(jī)理,1、由于錳的缺乏，抑制了蛋白質(zhì)的合成，而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的NH4+ 濃度升高，促進(jìn)了EMP途徑的暢通。 2、由組成型的丙酮酸羧化酶源源不斷提供草酰乙酸。 3、在控制Fe++含量的情況下，順烏頭酸酶活性低，從而使檸檬酸積累。 順烏頭酸水合酶在催化時(shí)建立如下平衡 檸檬酸：順烏頭酸：異檸檬酸＝90 ：3：7,4

10、、丙酮酸氧化脫羧生成乙酰輔酶Ａ和丙酮酸固定CO２反應(yīng)相平衡，以及檸檬酸合成酶不被抑制，增強(qiáng)了合成檸檬酸的能力?！?5、檸檬酸積累增加，pH降低，在低pH條件下，順烏頭酸水合酶和異檸檬酸脫氫酶失活，從而進(jìn)一步促進(jìn)了檸檬酸自身的積累。,第二節(jié)醋酸發(fā)酵機(jī)制淀粉 糖 酒精 醋酸 1. 醋桿菌發(fā)酵酒精成醋酸

11、 乙醇向醋酸轉(zhuǎn)化是分兩步進(jìn)行的，中間產(chǎn)物是乙醛。 CH3CH2 OH E1 CH3CHO E2 CH3COOH E1 乙醇脫氫酶 或乙醇氧化酶，它依賴于NAD。 E2 乙醛脫氫酶 ，需要NADP作輔酶。 醋桿菌為G-，好氧菌，　 1mol乙醇轉(zhuǎn)化為1mol

12、醋酸，理論轉(zhuǎn)化率是130％。,,,,,,,,2 熱醋酸梭菌生產(chǎn)醋酸 熱醋酸梭菌在發(fā)酵糖類時(shí)，由糖到醋酸一步完成，還可以將CO2還原為醋酸。 CO2是通過甲酰四氫葉酸（THF）和類咕啉蛋白形成醋酸的。但該菌沒有氫化酶活性，不能利用氫氣。 C6H12O6 +2H2O 2CH3COOH+2CO2+8H++8e 2CO2+8H++8e CH3COOH

13、+ 2H2O 凈反應(yīng)　　C6H12O6　　　　　　 3CH3COOH　　反應(yīng)在厭氧條件下進(jìn)行的，由己糖或戊糖生成醋酸的理論產(chǎn)率都是100％?！　岽姿崴缶鸀楫a(chǎn)芽孢菌，Ｇ＋，周生鞭毛，耐高溫，最適生長溫度55～60°C，轉(zhuǎn)化率高，嚴(yán)格厭氧，還可以利用戊糖。但這種方法發(fā)酵時(shí)需中和劑，因此只適合于醋酸鹽。,,,,第三節(jié) 谷氨酸發(fā)酵機(jī)制,氨基酸發(fā)酵工業(yè)是利用微生物的生長和代謝活動(dòng)生產(chǎn)各種氨基酸的現(xiàn)

14、代工業(yè)。氨基酸發(fā)酵是典型的代謝控制發(fā)酵。由發(fā)酵所生成的產(chǎn)物——氨基酸，都是微生物的中間代謝產(chǎn)物，它的積累是建立于對微生物正常代謝的抑制。也就是說，氨基酸發(fā)酵的關(guān)鍵是取決于其控制機(jī)制是否能夠被解除，是否能打破微生物的正常代謝調(diào)節(jié)，人為地控制微生物的代謝。,一.谷氨酸生物合成途徑 谷氨酸的生物合成途徑有EMP途徑、HMP途徑、 TCA循環(huán)、乙醛酸循環(huán)和CO2固定反應(yīng)。葡萄糖先生成谷氨酸，依次經(jīng)鳥氨酸，谷氨酸生物合成精氨酸。

15、 谷氨酸的生物合成途徑如圖所示。,二.谷氨酸生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制,三. 谷氨酸發(fā)酵的代謝控制 谷氨酸發(fā)酵的代謝控制一般采取下列措施。 1．控制發(fā)酵的環(huán)境條件 氨基酸發(fā)酵受菌種的生理特征和環(huán)境條件的影響，對專性好氧菌來說，環(huán)境條件的影響更大。谷氨酸發(fā)酵必須嚴(yán)格控制菌體生長的環(huán)境條件，否則就幾乎不積累谷氨酸。下表表示谷氨酸生產(chǎn)菌因環(huán)境條件改變而引起的發(fā)酵轉(zhuǎn)換，這也就是說氨基酸發(fā)酵是人為

16、地控制環(huán)境條件而使發(fā)酵發(fā)生轉(zhuǎn)換的一個(gè)典型例子。,2．控制細(xì)胞膜滲透性 在發(fā)酵過程中，控制使用那些影響細(xì)胞膜通透性的物質(zhì)，有利于代謝產(chǎn)物分泌出來，從而避免了末端產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)，有利于提高發(fā)酵產(chǎn)量。 以葡萄糖為原料，利用谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸時(shí)，谷氨酸生產(chǎn)菌為α-酮戊二酸脫氫酶缺失突變株，當(dāng)谷氨酸的合成達(dá)到50 mg/g（干細(xì)胞）時(shí)，由于反饋調(diào)節(jié)作用，谷氨酸的合成便終止。如果改變細(xì)胞膜通透性

17、，使胞內(nèi)代謝產(chǎn)物谷氨酸滲透到胞外，有利于提高發(fā)酵產(chǎn)量。,所以代謝產(chǎn)物的細(xì)胞滲透性是氨甚酸發(fā)酵必須考慮的重要因素。對于谷氨酸發(fā)酵來說，生物素是谷氨酸發(fā)酵的關(guān)鍵物質(zhì)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的生物素水平高時(shí)，谷氨酸不能透過細(xì)胞膜，因而得不到谷氨酸。 谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中，谷氨酸生產(chǎn)菌菌屬于生物素缺陷型菌種，生物素作為脂肪酸生物合成最初反應(yīng)的關(guān)鍵酶乙酰CoA羧化酶的輔酶，參與了脂肪酸的合成，進(jìn)而影響磷脂的合成。當(dāng)磷脂合成減少到正常量的一半左

18、右時(shí)，細(xì)胞變形，谷氨酸向膜外漏出，積累于發(fā)酵液中。,因而可以通過限量控制生物素的含量，也就是通過控制生物素亞適量，提高細(xì)胞膜的滲透性。 在發(fā)酵的前期，滿足細(xì)胞的生長，合成完整的細(xì)胞膜；中期生物素耗盡，細(xì)胞膜合成不完整，完成長菌型細(xì)胞向產(chǎn)酸型細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，細(xì)胞膜的滲透性增加，使得谷氨酸滲透到細(xì)胞外，在細(xì)胞內(nèi)谷氨酸達(dá)不到引起反饋調(diào)節(jié)的程度，從而使谷氨酸能夠源源不斷被優(yōu)先合成。,影響谷氨酸產(chǎn)生菌細(xì)胞膜通透性的物質(zhì)可分為兩大類

19、： 一類是生物素、油酸和表面活性劑，其作用是引起細(xì)胞膜的脂肪酸成分或量的改變，尤其是改變油酸含量，從而改變細(xì)胞膜通透性； 另一類是青霉素，其作用是抑制細(xì)胞壁肽聚糖合成中肽鏈的交聯(lián)，由于細(xì)胞膜失去細(xì)胞壁的保護(hù)，細(xì)胞膜受到物理損傷，從而使?jié)B透性增強(qiáng)。 另外，代謝控制還包括控制支路代謝，消除終產(chǎn)物的反饋抑制和反饋?zhàn)瓒舻鹊取?三、現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌的主要特征 從細(xì)菌

20、的鑒定和分類的結(jié)果來看，現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌分屬于捧狀桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬及節(jié)桿菌屬，但是它們在形態(tài)及生理方面仍有許多共同的特征。歸納起來主要有以下特征。（1）細(xì)胞形態(tài)為球形，棒形以至短桿形。（2）革蘭氏染色陽性，無芽孢，無鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)。 （3）都是需氧型微生物。 （4）都是生物素缺陷型。 （5）脲酶強(qiáng)陽性。 （6）不分解淀粉、纖維素、油脂、酪蛋白及明膠等。 （7）發(fā)酵中菌體發(fā)生明顯的形態(tài)變化，同時(shí)發(fā)生細(xì)胞膜滲透性的變

21、化。,（8）CO2固定反應(yīng)酶系活力強(qiáng)。（9）異檸檬酸裂解酶活力欠缺或微弱，乙醛酸循壞弱。（10）α-酮戊二酸氧化能力缺失或微弱。（11）還原型輔酶Ⅱ（NADPH2）進(jìn)入呼吸鏈能力弱。 （12）檸檬酸合成酶、烏頭酸梅、異檸檬酸脫氫酶以及谷氨酸脫氫酶活力強(qiáng)。 （13）能利用醋酸，不能利用石蠟。（14）具有向環(huán)境中泄漏谷氨酸的能力。 （15）不分解利用谷氨酸，并能耐高濃度的谷氨酸，產(chǎn)谷氨酸5%以上。,,第五節(jié) 抗

22、生素發(fā)酵機(jī)制 次級(jí)代謝產(chǎn)物---(secondary metabolite),分解代謝：將從環(huán)境中吸收的各種碳源、氮源等物質(zhì)降解，為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供能源和小分子中間體。如TCA、EMP和HMP等。合成代謝：利用分解代謝的能量和中間體合成氨基酸、核酸等單體物質(zhì)，及蛋白質(zhì)、核酸、多糖等多聚物。,代謝類型,初級(jí)代謝和次級(jí)代謝初級(jí)代謝：與生物生存有關(guān)的，涉及能量產(chǎn)生和能量消耗的代謝類型。產(chǎn)物都是有機(jī)體生存必不可少的

23、物質(zhì)，如單糖、核苷酸、脂肪酸，以及蛋白質(zhì)、核酸、多糖、脂類等。次級(jí)代謝：某些微生物為了避免代謝過程中，某種代謝產(chǎn)物的積累造成的不利作用，而產(chǎn)生的一類有利于生存的代謝類型，通常是在生長后期產(chǎn)生。產(chǎn)物種類很多，最著名的是抗生素，其它還有氨基糖、香豆素、麥角生物堿、吲哚衍生物、核苷、肽、喹啉等。,一、 次級(jí)代謝產(chǎn)物的特征,１、次級(jí)代謝產(chǎn)物是由微生物產(chǎn)生，不參與微生物的生長與繁殖。?。病⒋渭?jí)代謝產(chǎn)物的生物合成最少也要有一部分取決于與初級(jí)

24、代謝產(chǎn)物無關(guān)的遺傳物質(zhì)，并與由這類遺傳信息形成的酶所催化的代謝途徑有關(guān)。?。?、它的生產(chǎn)大多數(shù)是基于菌種的特異性來完成的。?。础⒋渭?jí)代謝產(chǎn)物發(fā)酵經(jīng)歷兩個(gè)階段，即營養(yǎng)增殖期和產(chǎn)物形成期。如在菌體活躍增殖階段幾乎不產(chǎn)生抗生素。待到細(xì)胞停止生長，進(jìn)入到恒定期才開始活躍地合成抗生素，成為生產(chǎn)期。,５、一般都同時(shí)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)上相類似的多中副組分。 ６、生產(chǎn)能力受微量金屬離子（Fe2+、 Fe3+、Mn2+、Co2+、Zn2+）和 磷酸鹽等無

25、機(jī)離子的影響。 ７、 在多數(shù)條件下，增加前體是有效的。 ８、 次級(jí)代謝酶的底物特異性在某種程度上說是比較廣的。若提供底物結(jié)構(gòu)類似物，則可得到與天然物不同的次級(jí)代謝物。 ９、培養(yǎng)溫度過高或菌種移植次數(shù)過多，使抗生素生產(chǎn)能力下降，可能的原因是參與抗生素合成的菌種的質(zhì)粒脫落。 １０、一種產(chǎn)物可由多種中間體和途徑來取得。,,二、生物合成抗生素與初級(jí)代謝的關(guān)系　 1.從代謝方面分析：　　許多抗生素的基本結(jié)構(gòu)是由少

26、數(shù)幾種初級(jí)代謝產(chǎn)物構(gòu)成的，所以次級(jí)產(chǎn)物是以初級(jí)產(chǎn)物為母體衍生出來的，次級(jí)代謝途徑并不是獨(dú)立的，而是與初級(jí)代謝途徑有密切聯(lián)系的。 糖代謝的中間體，即可以來合成初級(jí)代謝產(chǎn)物，又可以來合成次級(jí)代謝產(chǎn)物，這種中間體叫分叉中間體，如丙二酰CoＡ?！ 乙酰 CoＡ 丙二酰 CoA 　　　脂肪酸（初級(jí)）　　　　　　　　　　　　四環(huán)素或其他抗生素（次級(jí)）,,,,,初級(jí)代謝和次級(jí)代謝的

27、分叉中間體,分叉中間體　　初級(jí)終點(diǎn)產(chǎn)物　　次級(jí)終點(diǎn)產(chǎn)物氨基己二糖　　 賴氨酸　　 　 青霉素,頭孢酶素　　　丙二酰CoＡ　　　脂肪酸　　　　 四環(huán)素族,利福霉素族乙酰CoＡ 大環(huán)內(nèi)酯族,多烯族抗生素莽草酸　　　 對氨基苯丙氨酸　　　氯霉素,綠膿菌素　　　　　　苯丙氨酸,酪氨酸　　　新生霉素,由初級(jí)代謝產(chǎn)物衍生的次級(jí)代謝產(chǎn)物的途徑有七種：葡萄糖碳

28、架摻入途徑、莽草酸途徑、與核苷有關(guān)的途徑、聚酮糖途徑、由氨基酸衍生的途徑、甲羥戊酸途徑、其它復(fù)合途徑。,,,,,,,2.從遺傳方面分析：　　初級(jí)產(chǎn)物和次級(jí)產(chǎn)物同樣都受到核內(nèi)DNA的調(diào)節(jié)控制的。　　所不同的是次級(jí)代謝產(chǎn)物還受到“與初級(jí)代謝產(chǎn)物合成無關(guān)的遺傳物質(zhì)”的控制，即受核內(nèi)遺傳物質(zhì)（染色體遺傳物質(zhì)）和核外遺傳物質(zhì)（質(zhì)粒）的控制。有一部分代謝產(chǎn)物的形成，取決于由質(zhì)粒信息產(chǎn)生的酶所控制的代謝途徑，這類物質(zhì)稱為質(zhì)粒產(chǎn)物。由于這類物質(zhì)的形

29、成直接或間接受質(zhì)粒遺傳物質(zhì)的控制,因而產(chǎn)生了質(zhì)粒遺傳的觀點(diǎn)。當(dāng)然也有只由染色體DNA控制的抗生素。　　因此，兩者在遺傳上既有相同的部分，又有不同的部分。,三 抗生素生產(chǎn)菌的主要代謝調(diào)節(jié)機(jī)制,受DNA控制的酶合成的調(diào)節(jié)機(jī)制，包括酶的誘導(dǎo)和酶的阻遏（有終點(diǎn)產(chǎn)物和分解產(chǎn)物）； 酶活性的調(diào)節(jié)機(jī)制，包括終點(diǎn)產(chǎn)物的抑制或活化，利用輔酶的酶活調(diào)節(jié)、酶原的活化和潛酶的活化； 細(xì)胞膜透性的調(diào)節(jié)；,微生物的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制可從DN

30、A水平研究酶合成的調(diào)節(jié)機(jī)制和從酶化學(xué)觀點(diǎn)研究酶活性的調(diào)節(jié)機(jī)制兩方面著手，可分為：,微生物體內(nèi)的次級(jí)代謝和初級(jí)代謝一樣，都受菌體代謝的調(diào)節(jié)。次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)節(jié)與初級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)節(jié)在某些方面是相同的，也是調(diào)節(jié)參與生物合成的酶合成（誘導(dǎo)或阻遏）和控制酶活性（激活或抑制）。但次級(jí)代謝的調(diào)節(jié)也有其獨(dú)特的一面。以下是影響抗生素合成的主要代謝調(diào)節(jié)機(jī)制。,1 初級(jí)代謝對次級(jí)代謝的調(diào)節(jié),次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成途徑并不是獨(dú)立存在的，而是

31、與初級(jí)代謝產(chǎn)物合成途徑間存在著緊密的聯(lián)系。 次級(jí)代謝產(chǎn)物往往都是以初級(jí)代謝產(chǎn)物為母體衍生而來的，而且催化特殊次級(jí)代謝產(chǎn)物合成反應(yīng)的酶也可以從那些初級(jí)代謝途徑的酶演化而來。因此，微生物的初級(jí)代謝對次級(jí)代謝具有調(diào)節(jié)作用。,當(dāng)初級(jí)代謝和次級(jí)代謝具有共同的合成途徑時(shí)，初級(jí)代謝的終產(chǎn)物過量，往往會(huì)抑制次級(jí)代謝的合成，這是因?yàn)檫@些終產(chǎn)物抑制了在次級(jí)代謝產(chǎn)物合成中重要的分叉中間體的合成。 如賴氨酸和青霉素的生物合成過

32、程中有共同中間體α-氨基己二酸，當(dāng)培養(yǎng)液中賴氨酸過量時(shí)，則抑制α-氨基己二酸的合成，進(jìn)而影響到青霉素的合成。,2 碳代謝物的調(diào)節(jié),一般情況下，凡是能被微生物快速利用、促進(jìn)產(chǎn)生菌快速生長的碳源，對次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成都表現(xiàn)出抑制作用。這種抑制作用并不是由于快速利用碳源直接作用的結(jié)果，而是由于其代謝過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物引起的。 這種阻遏作用是由于菌體在生長階段，速效碳源（如葡萄糖和檸檬酸等）的分解產(chǎn)物阻遏了次級(jí)代謝

33、過程中酶系的合成，只有當(dāng)這類碳源耗盡時(shí)，才能解除其對參與次級(jí)代謝的酶的阻遏，菌體才能轉(zhuǎn)入次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成階段。,20世紀(jì)40年代初期就發(fā)現(xiàn)，青霉素發(fā)酵過程中，雖然葡萄糖被菌體利用最快，但對青霉素合成并不適宜。而乳糖利用雖然較為緩慢，卻能提高青霉素產(chǎn)量。 已知有許多次級(jí)代謝產(chǎn)物，如麥角生物堿、頭孢菌素C、螺旋霉素、紫色桿菌素、嘌呤霉素、吲哚霉素、絲裂霉素、桿菌肽、新生霉素、放線菌素和香豆素等的生物合成都受到葡萄糖的阻遏，

34、因而在這些產(chǎn)物的發(fā)酵過程中常采用其他碳源。,3 氮代謝物的調(diào)節(jié),許多次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成同樣受到氮分解產(chǎn)物的影響。對不同氮源的研究發(fā)現(xiàn)，黃豆餅粉等利用較慢的氮源，可以防止和減弱氮代謝物的阻遏作用，有利于次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成；而以無機(jī)氮或簡單的有機(jī)氮等容易利用的氮作為氮源（銨鹽、硝酸鹽、某些氨基酸）時(shí)，能促進(jìn)菌體的生長，卻不利于次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成。例如，易利用的銨鹽有利于灰色鏈霉菌迅速生長，但對鏈霉素合成則是最差的氮源。,4

35、 磷酸鹽的調(diào)節(jié),磷酸鹽不僅是菌體生長的主要限制性營養(yǎng)成分，還是調(diào)節(jié)次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的重要因素。過量的磷酸鹽也象葡萄糖一樣抑制次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成，這種抑制作用被稱為磷酸鹽調(diào)節(jié)。,★已發(fā)現(xiàn)過量磷酸鹽對四環(huán)素類、氨基糖苷類、多烯類和大環(huán)內(nèi)酯類等32種抗生素的生物合成產(chǎn)生阻抑作用。這些次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成只有在適當(dāng)?shù)牧姿猁}濃度下才能進(jìn)行。磷酸鹽濃度≥ 10mmol/L 往往對次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成有抑制

36、作用例如， 10mmol/L的磷酸鹽就能完全抑制殺假絲菌素的合成。,★ 磷酸鹽濃度的高低還能調(diào)節(jié)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成期出現(xiàn)的早晚，當(dāng)磷酸鹽接近耗盡時(shí)，才開始進(jìn)入次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成期。磷酸鹽起始濃度高，耗盡時(shí)間長，合成期就向后拖延。如金霉素、萬古霉素等的發(fā)酵都有這些現(xiàn)象?！?磷酸鹽還能使處于非生長狀態(tài)的、產(chǎn)抗生素的菌體逆轉(zhuǎn)成生長狀態(tài)的、不產(chǎn)抗生素的菌體。,5 ATP調(diào)節(jié),ATP直接影響次級(jí)代謝產(chǎn)物合成和糖代謝中某些酶的

37、活性。在四環(huán)素的生物合成中，ATP水平對四環(huán)素合成起調(diào)節(jié)作用。磷酸烯醇式丙酮酸在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶作用下生成草酰乙酸，再經(jīng)羧基轉(zhuǎn)移酶作用生成丙二酰CoA（四環(huán)素合成的前體），此途徑在四環(huán)素合成期起決定作用。而草酰乙酸是三羧酸（TCA）循環(huán)中的重要中間產(chǎn)物，催化其形成的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的合成受ATP和過量磷酸鹽的強(qiáng)烈抑制，從而降低了草酰乙酸的生成，最終降低了四環(huán)素生物合成前體丙二酰CoA的濃度，影響四環(huán)素的生物合成。,6

38、 酶的誘導(dǎo)調(diào)節(jié),結(jié)構(gòu)酶：是菌體生長繁殖所必需的酶系，它的產(chǎn)生一般不受培養(yǎng)基成分的影響； 誘導(dǎo)酶：是在一定的誘導(dǎo)物存在下，才能形成。 在次級(jí)代謝過程中，有些參與次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的酶為誘導(dǎo)酶，如鏈霉素生物合成中的轉(zhuǎn)脒基酶、甘露糖鏈霉素酶等。誘導(dǎo)酶需要有誘導(dǎo)物存在才能形成。誘導(dǎo)物起誘導(dǎo)作用，能提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。例如，蛋氨酸能提高頭孢菌素C的產(chǎn)量，其原因是蛋氨酸的誘導(dǎo)作用，而不是作為硫源的供給物。 誘導(dǎo)酶合

39、成的誘導(dǎo)劑有些需外源加入，而有些是菌體代謝過程中自身產(chǎn)生的。在抗生素的發(fā)酵過程中，有的初級(jí)代謝產(chǎn)物似乎對次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成酶也起誘導(dǎo)作用。,,7 反饋調(diào)節(jié),反饋調(diào)節(jié)包括反饋?zhàn)瓒艉头答佉种?。反饋?zhàn)瓒簦╢eedback repression)：作用于基因水平，控制酶的合成量，是終產(chǎn)物抑制生物合成途徑中的一種或多種酶形成的調(diào)節(jié)過程。反饋抑制 (feedback inhibition)：作用于分子水平，控制酶的活性，是合成途徑的終

40、點(diǎn)產(chǎn)物抑制該過程中第一步酶的活性作用。 兩者作用方式各異，功能也有所不同，目的都是防止產(chǎn)生過量的物質(zhì)，保證快速有效地適應(yīng)變換了的外界環(huán)境，對生長有利。,在抗生素的合成途徑中，★一方面是抗生素本身的過量積累，存在著與初級(jí)代謝相似的反饋調(diào)節(jié)現(xiàn)象。如氯霉素、卡那霉素、泰樂菌素、制霉菌素、瑞斯托霉素等抗生素都對本身的合成有抑制作用?！锪硪环矫?，初級(jí)代謝和次級(jí)代謝途徑是緊密相連的，初級(jí)代謝受到的反饋調(diào)節(jié)，也必然影響抗生素的合

41、成。如纈氨酸是合成青霉素的前體，其生物合成受到反饋調(diào)節(jié)，必然對青霉素的合成有影響。,8 細(xì)胞膜通透性調(diào)節(jié),次級(jí)代謝中也存在著膜通透性調(diào)節(jié)。菌體吸收外界營養(yǎng)物質(zhì)或分泌細(xì)胞內(nèi)的代謝物都必須經(jīng)過細(xì)胞質(zhì)膜的運(yùn)輸。如果細(xì)胞對某種物質(zhì)不能運(yùn)輸，或是運(yùn)輸功能發(fā)生了障礙，將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)合成代謝的產(chǎn)物不能分泌出去，影響發(fā)酵產(chǎn)物的生成和收獲；或者是細(xì)胞外的營養(yǎng)物質(zhì)不能進(jìn)入菌體或進(jìn)入很少，從而影響產(chǎn)生菌的生長和產(chǎn)物的合成，造成產(chǎn)量下降。,在青霉素的發(fā)酵

42、中，產(chǎn)生菌細(xì)胞膜輸入硫化物的能力是影響青霉素發(fā)酵單位的一個(gè)重要因素。誘變選育出來的青霉素高產(chǎn)菌株中，有些突變株就是因?yàn)楦淖兞思?xì)胞膜的通透性，使硫酸鹽更容易透過細(xì)胞膜，提高了胞內(nèi)硫酸鹽濃度，進(jìn)而促進(jìn)了青霉素前體物半胱氨酸的合成，最終提高了青霉素的產(chǎn)量。 細(xì)胞膜通透性是代謝調(diào)節(jié)的一個(gè)重要方面，可以通過改變某些次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生菌的膜通透性來提高其產(chǎn)量。,9 金屬離子和溶解氧的調(diào)節(jié),★ 在多數(shù)情況下，微量的金屬離子是

43、參與次級(jí)代謝產(chǎn)物合成酶的活化因子，甚至有時(shí)在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯水平上起作用。如， Mg 2+可增加卡那霉素合成中的卡那霉素乙酰化酶、乙?？敲顾匕坊负透ナ湘溍咕膲A性磷酸酶的活力，促進(jìn)這些酶的合成。,★有些金屬離子（如Mg 2+和Ca 2+等）可解除產(chǎn)生菌（卡那霉素、新生霉素和鏈霉素等產(chǎn)生菌）對所產(chǎn)抗生素的特異性吸附作用，使抗生素從菌絲上游離下來，促進(jìn)產(chǎn)物分泌?！镞€有一些金屬離子（如Mg 2+）可增加產(chǎn)生菌對所產(chǎn)抗生素的抗性。,次級(jí)代謝產(chǎn)

44、物的發(fā)酵過程需要適量的溶解氧，溶解氧的降低影響次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成。例如，由青霉素N進(jìn)行頭孢菌素合成時(shí)，氧分壓的增大促進(jìn)頭孢菌素的合成，同時(shí)加入KCN或降低攪拌速度合成量則減少。,10 營養(yǎng)期（生長期）與分化期（生產(chǎn)期）的關(guān)系,次級(jí)代謝的一個(gè)特征是次級(jí)代謝物通常是在生長階段（營養(yǎng)期）之后的生產(chǎn)階段（分化期）合成。 次級(jí)代謝產(chǎn)物的形成出現(xiàn)較遲，這也許是抗生素產(chǎn)生菌避免自殺的主要機(jī)制之一。產(chǎn)物的形成是在某些營養(yǎng)成分從

45、培養(yǎng)基中耗竭時(shí)開始的。易利用的糖、氨（NH3）或磷酸鹽的消失使次級(jí)代謝物阻遏作用的解除。,四 抗生素的生物合成機(jī)制　　 青霉素、頭孢霉素的生物合成機(jī)制 青霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu) 帶?；膫?cè)鏈和6－氨基青霉烷酸 頭孢霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu) 氨基己二酸側(cè)鏈和7－氨基頭孢霉烷酸,,Q：,1、試從代謝途徑說明如何提高檸檬酸的產(chǎn)量？2、谷氨酸生物合成途徑.3、谷氨酸生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制.4