保健食品的毒理和功能學(xué)檢驗及評價

1、保健食品毒理和功能檢驗及評價,仲 偉 鑒上海市疾病預(yù)防控制中心,2010.10,主要內(nèi)容提綱,中國保健食品簡介 保健食品安全性毒理學(xué)檢驗與評價 保健食品新原料安全性毒理學(xué)評價原則 保健食品安全性毒理學(xué)評價中存在的問題 保健食品功能性檢驗與評價 保健食品功能評價方法更改情況,第一部分,中國保健食品簡介,第二部分,保健食品安全性毒理學(xué)檢驗及評價,主 要 內(nèi) 容,檢驗評價依據(jù) 審評基本要求 選擇毒理學(xué)試驗的基本原則

2、 實驗動物的選擇 樣品的預(yù)處理原則 毒理學(xué)試驗項目要點介紹 毒理學(xué)安全性評價時應(yīng)考慮的問題 審評結(jié)論的判定,毒性及功能檢驗評價依據(jù),1996年3月衛(wèi)生部《保健食品的管理方法》 保健食品的標準、功能評價、審批程序和監(jiān)督管理辦法1996年7月GB15193《食品安全性毒理學(xué)評價程序和方法》 衛(wèi)生部《保健食品功能學(xué)評價程序和檢驗方法》 僅包含了12項功能檢驗及評價方法2001年7月 衛(wèi)生部《保健

3、食品功能學(xué)評價程序和檢驗方法》 可受理和評價的功能調(diào)整到31項2003年2月衛(wèi)生部《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》 將功能學(xué)、毒理學(xué)、功效成分及衛(wèi)生指標檢驗評價方法三者合一,審評的基本要求,1. 配方 原（輔）料、用量、理化性質(zhì)2. 劑量 食用方法及用量3. 工藝 規(guī)格化產(chǎn)品 符合配方、工藝、質(zhì)量標準4. 批號 注意批號是否一致,益生菌、奶制品等保

4、質(zhì)期短的除外,1. 毒理學(xué)評價的四個階段第一階段：急性毒性試驗 經(jīng)口急性毒性試驗：LD50，聯(lián)合急性毒性，一次最大耐受量試驗第二階段：遺傳毒性試驗，30天喂養(yǎng)試驗，傳統(tǒng)致畸試驗 遺傳毒性試驗：原核細胞和真核細胞，體內(nèi)試驗和體外試驗相結(jié)合Ames或基因突變試驗；微核試驗或染色體畸變試驗；精子畸變試驗等第三階段：亞慢性毒性試驗 90天喂養(yǎng)試驗、繁殖試驗、代謝試驗第四階段：慢性毒性試驗（包括致癌試驗）,選

5、擇毒理學(xué)試驗的基本原則,2.無需進行毒性試驗的保健食品以普通食品和衛(wèi)生部規(guī)定的藥食同源物質(zhì)為原料生產(chǎn)的； 1）以傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)且食用方式與傳統(tǒng)方式相同的 2）以水提物配制生產(chǎn)、服用量為原料常規(guī)用量，且資料未提示具有不安全性用已列入營養(yǎng)強化劑或營養(yǎng)素補充劑名單的營養(yǎng)素化合物為原料的，如其原料來源、生產(chǎn)工藝和產(chǎn)品質(zhì)量均符合國家有關(guān)要求；,選擇毒理學(xué)試驗的基本原則,3. 需進行一階段和三項致突變毒性試驗的保健食品 屬于普通食品

6、和衛(wèi)生部規(guī)定的藥食同源的物質(zhì)且用水提以外的其它常用工藝生產(chǎn)的：（1）服用量與常規(guī)用量相同 急性毒性、三項致突變試驗（2）服用量大于常規(guī)用量 還需加做30天喂養(yǎng)試驗，必要時進行傳統(tǒng)致畸試驗和第三階段毒性試驗,選擇毒理學(xué)試驗的基本原則,選擇毒理學(xué)試驗的基本原則,4. 需進行一、二階段毒性試驗的保健食品 以普通食品和衛(wèi)生部規(guī)定的藥食同源物質(zhì)以及允許用作保健食品的物質(zhì)以外的動植物或動植物提取物、微生物、化學(xué)合成

7、物等為原料生產(chǎn)的保健食品，原則上須進行第一、二階段的毒性試驗，必要時進行下一階段的毒性試驗。衛(wèi)生部規(guī)定允許使用的動植物及其提取物或微生物為原料的。,5.需進行一至三階段毒性試驗的情況：一、二階段試驗結(jié)果與國外產(chǎn)品不一致的國外少數(shù)國家或地區(qū)食用的原料或成分水提取物，大于常規(guī)服用量用水提以外的其它常用工藝生產(chǎn)的，大于常規(guī)用量,選擇毒理學(xué)試驗的基本原則,6.需進行一至四階段毒性試驗的原料和成分國內(nèi)外均無食用先例7.敏感指標及

8、敏感試驗的保健食品不同食用人群和（或）不同功能的保健食品,選擇毒理學(xué)試驗的基本原則,對受試保健食品的要求,單一已知化學(xué)成分，應(yīng)提供物理和化學(xué)性質(zhì) 多種原料的配方產(chǎn)品，應(yīng)提供配方 配方產(chǎn)品，必要時還應(yīng)提供各組分，功效成分的 物理和化學(xué)性質(zhì)及其檢測報告 提供原料來源、生產(chǎn)工藝、人的可能攝入量。使 用說明書等有關(guān)資料 受試物應(yīng)符合既定配方和生產(chǎn)工藝的規(guī)格化產(chǎn)品,實驗動物的選擇及給樣量,1.根據(jù)各項實驗的具體要求，合理選擇

9、實驗動物 常用大鼠和小鼠，品系不限，推薦使用近交系。2.動物應(yīng)符合《實驗動物管理條例》 清潔級或清潔級以上 動物合格證號及動物實驗室合格證號3.灌胃量 大鼠：10 ml/kg?BW（若以水為溶劑，推薦 20 ml/kg?BW） 小鼠：20ml/kg?BW,樣品的預(yù)處理原則,1.介質(zhì)的選擇 應(yīng)選擇適合于受試動物的溶劑、乳化劑、助懸劑，要求無毒、與受試物不發(fā)生反應(yīng)、

10、穩(wěn)定性好。 常用的介質(zhì)有：蒸餾水、食用植物油、淀粉、明膠及羧甲基纖維素等。2.液體類 受試物濃縮倍數(shù)應(yīng)符合試驗要求。 濃縮方法不應(yīng)破壞其有效成份，常用的有60℃～70℃減壓或常壓蒸發(fā)、冷凍干燥。 按工藝要求。,樣品的預(yù)處理原則,3.袋泡茶類 處理方法與產(chǎn)品推薦飲用方法相同 推薦用：80℃--90℃ 常壓用水浸泡30min 水量為受試物的10倍，提取2次，2次提取液合并濃縮

11、至所需濃度 標明該濃縮液與受試物的比例,樣品的預(yù)處理原則,4.含乙醇類（1）不需濃縮的受試物 乙醇濃度15％ 乙醇濃度應(yīng)調(diào)至15％（2）需濃縮的受試物 乙醇濃度15％ 濃縮后調(diào)至15％乙醇濃度 在進行乙醇濃度調(diào)整時必須用原酒基,樣品的預(yù)處理原則,5.膨脹系數(shù)較高的受試物 選擇可溶性介質(zhì) 給受試物的方法：灌胃 其最高濃度最大灌胃量時達不到人體推薦量的1

12、00倍，按采用實際達到的倍數(shù) 標明受試物的膨脹系數(shù),樣品的預(yù)處理原則,6.益生菌等微生物類保健食品 在進行 Ames試驗或體外細胞試驗時需將受試物滅活。 需濃縮的應(yīng)采用低溫干燥法或由企業(yè)提供所需濃度的受試物（附方法、技術(shù)參數(shù)）。7.以食品為載體的受試物 （1）有營養(yǎng)價值：按設(shè)計量進行飼料的營養(yǎng)成份調(diào)整，提供詳細的說明。 （2）大豆蛋白、乳清蛋白 如質(zhì)量、工藝等符合食品標準和安全要求，允許去除。

13、 如僅以該原料生產(chǎn)的，可申請免做毒理學(xué)試驗。,毒理學(xué)試驗項目要點介紹,急性經(jīng)口毒性試驗 鼠傷寒沙門氏菌（Ames）試驗 骨髓細胞微核試驗 哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗 小鼠精子畸形試驗 小鼠睪丸染色體畸變試驗 30天喂養(yǎng)試驗,急性經(jīng)口毒性試驗,目的：測定LD50，毒性分級。了解毒性強度、性質(zhì)和可能的靶器官，為進一步的毒性試驗提供劑量和觀察指標的選擇依據(jù)。原理：急性毒性：經(jīng)口一次性、24h內(nèi)多次給予，短時間內(nèi)的

14、毒性反應(yīng)。致死劑量通常用半數(shù)致死劑量LD50表示。急性聯(lián)合毒性：兩種或兩種以上的受試物，可能發(fā)生拮抗、相加或協(xié)同的聯(lián)合方式，可以根據(jù)一定的公式計算和判定標準來確定這三種不同的作用。,急性經(jīng)口毒性試驗,時間周期：一般為3周 3-5天，大、小鼠適應(yīng)期 7-14天，染毒及實驗觀察期 發(fā)生動物死亡時，應(yīng)進行大體解剖觀察和評價指標：毒性反應(yīng)癥狀：各器官系統(tǒng)的異常表現(xiàn)（中樞、自主神經(jīng)、呼吸、心血管、胃腸、生殖泌尿

15、系統(tǒng)、皮毛、粘膜等）及體重變化死亡情況：死亡的時間、數(shù)量、性別、表現(xiàn)等。大體尸檢結(jié)果：如果發(fā)生死亡動物,急性毒性（LD50）劑量分級表,急性經(jīng)口毒性試驗,試驗結(jié)果的判定：1. LD50＜人可能攝入量的100倍，放棄；反之繼續(xù)下一步試驗。2. LD50≥10g/kgbw或按最大耐受量染毒而未出現(xiàn)動物死亡的，可繼續(xù)下一步試驗。,鼠傷寒沙門氏菌（Ames）試驗,目的：檢測受試物的誘變性，預(yù)測其遺傳危害和潛在致癌作用的可能性。 時間周

16、期：一般為2周 第一周，鼠傷寒沙門氏菌種、試劑、培養(yǎng)基準備 第二周，染毒，培養(yǎng)48h，菌落計數(shù)劑量設(shè)計：決定受試物最高劑量的因素是對細菌的毒性及其溶解度。最低劑量為0.2ug/皿；最高劑量為5mg/皿，或最大溶解劑量，最大飽和劑量以及最小毒性劑量?？稍O(shè)五個劑量組，組間距不超過5倍。同時設(shè)：陽性對照組，溶劑對照組和未處理對照組。,鼠傷寒沙門氏菌（Ames）試驗,觀察及評價指標： 各受試物組及三個對照組的四種菌株（

17、TA97a，TA98，TA100和TA102）分別在加和不加S9情況下的菌落計數(shù)。結(jié)果評價（摻入法）： 受試物組回變菌落數(shù)增加一倍以上（即回變菌落數(shù)≥2×未處理對照組數(shù)），并有劑量反應(yīng)關(guān)系或有可重復(fù)的陽性反應(yīng)，即可判試驗陽性。,骨髓細胞微核試驗,目的：檢測整體動物體內(nèi)骨髓嗜多染紅細胞微核發(fā)生率，以評價受試物致突變的可能性。原理：微核是在細胞有絲分裂后期染色體有規(guī)律地進入子細胞形成細胞核時，仍然留在細胞質(zhì)中的色單

18、體或染色體的無著絲點斷片 。末期之后，單獨形成一個或幾個規(guī)則的次核，被包含在細胞胞質(zhì)內(nèi)，因比主核小，故稱為微核。,骨髓細胞微核試驗,時間周期：一般為2周 3-5天適應(yīng)期 小鼠經(jīng)口染毒，30h給受試物法 取胸骨或股骨，收集骨髓，涂片，染色，鏡檢劑量設(shè)計：至少設(shè)置3個劑量，最高劑量組為動物出現(xiàn)嚴重中毒表現(xiàn)和/或個別動物出現(xiàn)死亡的劑量。低劑量組應(yīng)不出現(xiàn)毒性反應(yīng)。一般取LD50的1/2、1/4、1/8作為三個劑量。當受

19、試物的LD50≥10g/kg.bw時，最高劑量通常采用10g/kg.bw。同時設(shè)陽性對照組和溶劑對照組。,骨髓細胞微核試驗,觀察及評價指標：每只動物計數(shù)1000個嗜多染紅細胞 ，記錄含有微核的細胞數(shù)，并計算微核千分率。同時觀察嗜多染紅細胞與成熟紅細胞的比例。 結(jié)果評價：受試物組與對照組微核率相比，增高呈劑量反應(yīng)關(guān)系并有統(tǒng)計學(xué)意義，試驗結(jié)果為陽性。,哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗,目的：檢測受試物對整體動物骨髓細胞染色體畸變的致突變

20、性，以評價其致突變的可能性。原理：當受試物作用于細胞周期G1期和S期時，可誘發(fā)染色體型畸變，而作用于G2期時則誘發(fā)染色體單體型畸變。給動物腹腔注射秋水仙素，抑制細胞分裂時紡錘體的形成，增加中期分裂相細胞的比例，并使染色體絲縮短、分散，輪廓清晰。在顯微鏡下便可觀察染色體數(shù)目和形態(tài)。,哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗,時間周期：一般為3周 3-5天適應(yīng)期 小鼠或大鼠經(jīng)口染毒2-4次，每次間隔24h，在末次染毒18-24h

21、進行取材（取材前2-4h，腹腔注射秋水仙素）。 取股骨，收集骨髓，制片，染色，鏡檢劑量設(shè)計：同骨髓細胞微核試驗,哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗,觀察及評價指標：每只動物分析100個中期相細胞 ，每個劑量組不少于1000個。記錄染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果評價：受試物組與對照組染色體畸變率相比，增高呈劑量反應(yīng)關(guān)系并有統(tǒng)計學(xué)意義，試驗結(jié)果為陽性。,小鼠精子畸形試驗,目的：檢測整體動物體內(nèi)精子畸形發(fā)生率，以評價受試物對體內(nèi)

22、生殖細胞的致突變作用。原理：小鼠精子畸形受基因控制，具有高度遺傳性，許多常染色體及X、Y性染色體基因決定精子形態(tài)。精子的畸形主要是指形態(tài)的異常，已知精子的畸形是決定精子形成的基因發(fā)生突變的結(jié)果。因此形態(tài)的改變提示有關(guān)基因及其蛋白產(chǎn)物的改變。,小鼠精子畸形試驗,時間周期：一般為7周 3-5天適應(yīng)期 小鼠經(jīng)口連續(xù)染毒5天，于首次給樣后的35天處死動物 取兩側(cè)附睪，收集精子，滴片，染色，鏡檢劑量設(shè)計：同骨髓

23、細胞微核試驗,小鼠精子畸形試驗,觀察及評價指標：每只動物檢查1000個精子 ，記錄精子畸形數(shù)目及類型。結(jié)果評價：受試物組與對照組精子畸變率相比，增高呈劑量反應(yīng)關(guān)系并有統(tǒng)計學(xué)意義，試驗結(jié)果為陽性。,小鼠睪丸染色體畸變試驗,目的：檢測整體動物睪丸染色體畸變發(fā)生率，以評價受試物對整體哺乳動物睪丸生殖細胞的致突變性。原理：不同周期的雄性生殖細胞對化學(xué)物質(zhì)的敏感性不同，多數(shù)情況下化學(xué)誘變劑誘發(fā)染色體畸變必須經(jīng)過DNA復(fù)制期，故在前細線期處

24、理。第12～14d采樣，以觀察作用于前細線期引起的精母細胞染色體畸變效應(yīng)。,小鼠睪丸染色體畸變試驗,時間周期：一般為7周 3-5天適應(yīng)期 小鼠經(jīng)口連續(xù)染毒5天，與首次給樣后的12-14天處死動物取材，（取材前6h，腹腔注 射秋水仙素）。取兩側(cè)睪丸，收集生殖細胞，滴片，染色，鏡檢劑量設(shè)計：同骨髓細胞微核試驗,小鼠睪丸染色體畸變試驗,觀察及評價指標：每只動物分析100個中期相細胞 ，記錄染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)的改變（包

25、括斷片、易位、畸變細胞率、常染色體單價體、性染色體單價體等）。結(jié)果評價：受試物組與對照組的斷片、易位、畸變細胞率、常染色體單價體、性染色體單價體等差異有統(tǒng)計學(xué)意義，試驗結(jié)果為陽性。,遺傳毒性試驗組合,試驗結(jié)果的判定：如三項致突變試驗（Ames試驗，微核或骨髓細胞染色體畸變試驗，精子畸形或睪丸染色體畸變試驗）中，體外或體內(nèi)有一項或以上陽性，一般應(yīng)放棄該受試物用于保健食品。如三項試驗均為陰性，則可繼續(xù)進行下一步的毒性試驗。,30天喂

26、養(yǎng)試驗,目的：急性毒性試驗的基礎(chǔ)上，此試驗可進一步了解毒性作用，特別是觀察對生長發(fā)育的影響，并可初步估計最大觀察到的無作用劑量，估計亞慢性攝入的危害性。原理： 以不同劑量受試物每日經(jīng)口給予各組實驗動物，連續(xù)30天。染毒期間每日密切觀察動物的毒性反應(yīng)，染毒結(jié)束后進行大體解剖、血生化及病理檢查，以此觀察重復(fù)喂食不同劑量的受試物對動物引起的有害作用。,30天喂養(yǎng)試驗,時間周期：在獲得了急性毒性數(shù)據(jù)后，一般為2月 3-5天，大鼠適

27、應(yīng)期 30天，染毒及實驗觀察期 再進行大體解剖、血液、生化、器官病 理檢查。,30天喂養(yǎng)試驗,劑量設(shè)計：至少設(shè)三個劑量組和一個對照組。高劑量應(yīng)能引起動物明顯毒效應(yīng)但不造成動物死亡。低劑量應(yīng)不出現(xiàn)任何毒作用，同時在這二劑量之間設(shè)幾個中間劑量組。 對于能獲得LD50的受試物：最高劑量為10％～25％的LD50，最低劑量組至少為人可能攝入量的3倍。 對于不能獲得LD50的受試物：最高

28、劑量為人可能攝入量的100倍，或按最大灌胃劑量或在飼料中的最大摻入量。,30天喂養(yǎng)試驗,觀察及評價指標：一般情況觀察：每日的表現(xiàn)、行為、中毒和死亡情況。每周1次體重及2次食物攝入量，計算食物利用率。血液學(xué)指標：喂養(yǎng)結(jié)束后測定血紅蛋白、紅和白細胞總數(shù)及分類，必要時測定血小板或網(wǎng)織紅細胞數(shù)等指標。生化學(xué)指標：喂養(yǎng)結(jié)束后測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、肌肝、血糖、白蛋白、總蛋白、膽固醇和甘油三酯。病理檢查：大體解剖、臟器稱重、組織

29、病理學(xué)檢查。,30天喂養(yǎng)試驗,試驗結(jié)果的判定： 對于只要求進行一、二階段試驗者，最大未觀察到有害作用劑量≥人可能攝入量的100倍，綜合其它試驗結(jié)果可初步做出安全性評價。 最小觀察到有害作用劑量≤人可能攝入量的100倍，或觀察到毒性反應(yīng)的最小劑量組其受試物在飼料中比例≤10％，放棄。 在中低劑量組中個別指標與對照組相比有差異，應(yīng)綜合分析，決定取舍或進行下一步毒理試驗。,其它試驗結(jié)果判斷,傳統(tǒng)致畸試驗： 需大于

30、或等于人攝入量的100倍。在50倍至100倍之間需進行安全性評價，小于50倍需放棄。 90天喂養(yǎng)試驗、繁殖試驗：1.僅在國外少數(shù)國家或國內(nèi)局部地區(qū)有食用歷史的原料或成分，需大于或等于人攝入量的100倍。2.國內(nèi)外均無食用歷史的原料或成分時，需大于或等于人攝入量的300倍。在100倍至300倍之間需進行慢性毒性試驗，小于100倍需放棄。,其它試驗結(jié)果判斷,慢性毒性試驗： 以LD50或30天喂養(yǎng)試驗的最大未觀察到有害作用劑量設(shè)計

31、受試物各劑量組，未見有毒性作用。 致癌試驗陽性判定依據(jù)：腫瘤只發(fā)生在實驗組動物，對照組中無腫瘤發(fā)生。實驗組和對照組均發(fā)生腫瘤，但實驗組發(fā)生率高。實驗組和對照組腫瘤發(fā)生率無明顯差異，但實驗組發(fā)生時間較早。符合以上三項中的情況之一，并經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理有統(tǒng)計學(xué)意義，可認為致癌試驗陽性。,安全性評價的科學(xué)性和藝術(shù)性,安全性評價的藝術(shù)性：1.動物實驗結(jié)果外推到人必須考慮動物與人的種屬差異；2.安全性標準與社會經(jīng)濟基礎(chǔ)、技術(shù)能力的相符性；

32、3.安全性標準與社會和公眾利益之間的平衡性。結(jié)論：在對化學(xué)物質(zhì)進行科學(xué)地安全性評價之后，應(yīng)結(jié)合試驗的局限性，社會經(jīng)濟狀況，人們的生活習(xí)慣等因素，對評價結(jié)果作出一個合理的分析，為衛(wèi)生標準的制定提供具有實際指導(dǎo)意義的依據(jù)。,應(yīng)綜合考慮的問題,1.試驗指標的統(tǒng)計學(xué)意義和生物學(xué)意義 在分析試驗組與對照組指標統(tǒng)計學(xué)的顯著性時，應(yīng)根據(jù)其有無劑量反應(yīng)關(guān)系及與本實驗室的歷史性對照值范圍比較的原則,來綜合考慮指標差異有無生物學(xué)意義。2.

33、生理作用與毒性作用 對實驗中某些指標的異常改變，在結(jié)果分析時要注意區(qū)分是生理學(xué)表現(xiàn)還是受試物的毒性作用。,應(yīng)綜合考慮的問題,3.時間-毒性效應(yīng)關(guān)系 對由受試物引起的毒性效應(yīng)進行分析評價時，要考慮在同一劑量水平下毒性效應(yīng)隨時間的變化情況。4.特殊人群和敏感人群 對孕婦、乳母或兒童食用的保健食品，應(yīng)特別注意其胚胎毒性或生殖發(fā)育毒性、神經(jīng)毒性和免疫毒性。,應(yīng)綜合考慮的問題,5.人的可能攝入量較大的保健食品

34、 應(yīng)考慮給予受試物量過大時，可能影響營養(yǎng)素攝入量及其生物利用率，從而導(dǎo)致某些毒理學(xué)表現(xiàn)，而非受試物本身的毒性作用所致。6.含乙醇的保健食品 對實驗中出現(xiàn)的某些指標的異常改變，在結(jié)果分析評價時應(yīng)注意區(qū)分是乙醇本身還是其它成分的作用。,應(yīng)綜合考慮的問題,7.動物年齡對試驗結(jié)果的影響 對實驗中出現(xiàn)的某些指標的異常改變，要考慮是否因動物年齡選擇不當所致。8.安全系數(shù) 鑒于動物、人的種屬和個體之

35、間的生物學(xué)差異，安全系數(shù)通常為100。,應(yīng)綜合考慮的問題,9.人體資料 在評價保健食品的安全性時，應(yīng)盡可能收集人群食用受試物后反應(yīng)的資料。10.綜合評價 在對保健食品進行最后評價時，必須綜合考慮受試物的原料來源、理化性質(zhì)、毒性大小、代謝特點、蓄積性、接觸的人群范圍、食品中的使用范圍、人的可能攝入量及保健功能等因素，確保其對人體健康的安全性。,應(yīng)綜合考慮的問題,11.保健食品安全性的重新評價：很早的毒性評價可 能

36、因為當時科學(xué)水平和技術(shù)條件的限制，現(xiàn)已不適用需重新評價。12.若受試物摻入飼料的最大加入量（10％）或液體受試物經(jīng)濃縮后仍達不到最大觀察到有害作用劑量為人的可能攝入量的規(guī)定倍數(shù)時，如何綜合其它的毒性試驗結(jié)果進行安全性評價。,審評結(jié)論的判定,1.認可毒理學(xué)試驗：試驗設(shè)計合理，操作規(guī)范，試驗結(jié)果能夠證明受試物的安全性。2.屬以下幾種情況之一，補充資料后建議批準：（1）檢驗報告格式不規(guī)范，需要重新出具檢驗報告毒理學(xué)試驗報告。（2）數(shù)據(jù)

37、偏離歷史對照較大，需檢驗機構(gòu)做出解釋。（3）未提供某些試驗數(shù)據(jù)，需要補充提供。,審評結(jié)論的判定,3.重做試驗，大會再審，屬以下幾種情況之一：（1）由于實驗操作不規(guī)范，根據(jù)提供的檢驗報告無法評價產(chǎn)品的安全性，需要做除30天/90天喂養(yǎng)試驗以外的毒理學(xué)試驗；（2）已有數(shù)據(jù)提示可能存在安全性問題，但難以下結(jié)論，需要重復(fù)試驗。,（1）毒理學(xué)評價的結(jié)果表明產(chǎn)品在推薦劑量下對人體具有一定的毒性，存在安全性問題。（2）產(chǎn)品的原料、配方存在明顯

38、的安全性問題，如配方含有“可用于保健食品的原料”名單以外的原料，且未進行新資源食品安全性毒理學(xué)評價。（3）選擇安全性毒理學(xué)試驗不符合程序規(guī)定，未完成相應(yīng)階段的毒理學(xué)試驗。,4.對產(chǎn)品的安全性不予認可的情況如下（一）：,（4）毒理、功能、興奮劑與衛(wèi)生學(xué)、穩(wěn)定性試驗樣品的批號不一致。（5）未按規(guī)定提供安全性毒理學(xué)評價資料的。（6）30天/90天喂養(yǎng)試驗劑量設(shè)計不合理或某些指標異常，結(jié)果不可信。,4.對產(chǎn)品的安全性不予認可的情況如下(二

39、)：,第三部分,保健食品新原料安全性毒理學(xué)評價原則,保健食品新原料（以下簡稱新原料）是指不在國家食品藥品監(jiān)督管理局公布的可用于保健食品、衛(wèi)生部公布或批準可以食用以及生產(chǎn)普通食品的范圍內(nèi)，擬用于保健食品的原料。 國家食品藥品監(jiān)督管理局和國家有關(guān)部門規(guī)定的不可用于保健食品以及禁止使用的物品，不得作為新原料。,保健食品新原料定義,在已批準的保健食品中使用過，或衛(wèi)生部已批準為新資源食品的原料，符合以下情況的仍按新原料進行管理：未列入

40、國家食品藥品監(jiān)督管理局公布的可用于保健食品的物品名單；尚未列入衛(wèi)生部公布或批準的食品新資源或新資源食品名單內(nèi)；衛(wèi)生部已批準為食品新資源或新資源食品，但保健食品注冊申請人與食品新資源或新資源食品生產(chǎn)批件中載明的申報單位不一致。,保健食品新原料定義,評價新原料安全性的基本原則,符合國家標準和衛(wèi)生要求，無國家標準的應(yīng)當提供行業(yè)標準或自行制定并在相關(guān)部門備案的質(zhì)量標準；新原料的名稱、物種（基源）、生物學(xué)或生態(tài)學(xué)特征、來源及使用部位應(yīng)確切；

41、加工工藝安全合理，質(zhì)量穩(wěn)定、可控；主要成分（或組成）、化學(xué)結(jié)構(gòu)明確，含量穩(wěn)定；適宜人群范圍和可能攝入量明確，確定依據(jù)充分；,評價新原料安全性的基本原則,國內(nèi)外安全性毒理學(xué)文獻資料、人體食用情況的檢索報告及流行病學(xué)資料顯示，該新原料無食用中毒或有害作用史；安全性毒理學(xué)試驗結(jié)果顯示，該原料在可能攝入量下對人體不產(chǎn)生急性、慢性或其它潛在的健康危害；微生物類新原料必須有食用習(xí)慣和安全食用歷史，培養(yǎng)基、菌種及其代謝產(chǎn)物必須無毒無害。,新原

42、料安全性毒理學(xué)試驗項目的選擇 ①無食用史 需做四階段試驗 ②局部地區(qū)有食用史 需做三階段試驗 可只做一、二階段實驗的包括 1）推薦食用量未超過人群常規(guī)用量的新原料，若根據(jù)有關(guān)文獻資料及成分分析，未發(fā)現(xiàn)有毒或毒性甚微不至對健康構(gòu)成損害，或者較大數(shù)量人群有長期食用歷史且未發(fā)現(xiàn)有害作用的 2）已有權(quán)威機構(gòu)進行系統(tǒng)的毒理學(xué)安全性評價，且有資料證明所用原料與其一致 如試驗結(jié)果與權(quán)威機構(gòu)

43、進行的評價不一致，需進入下階段的試驗,新原料安全性毒理學(xué)試驗要求,新原料安全性毒理學(xué)試驗項目的選擇 ③ 多個國家或國內(nèi)多數(shù)地區(qū)廣泛食用 1）推薦食用量未超過人群常規(guī)用量：先進行第一、二階段毒性試驗，根據(jù)試驗結(jié)果決定是否進行下一階段毒理學(xué)試驗 2）推薦食用量超過人群常規(guī)用量：進行第一、二、三階段的毒性試驗，根據(jù)試驗結(jié)果決定是否進行第四階段毒性試驗。,新原料安全性毒理學(xué)試驗要求,新原料安全性毒理學(xué)試

44、驗項目的選擇 ④ 根據(jù)新原料的特性、作用機制、已有的試驗資料及產(chǎn)品的適宜人群等信息，有針對性地選擇敏感試驗、敏感動物、敏感指標，以全面了解新原料的毒性。,新原料安全性毒理學(xué)試驗要求,新原料安全性毒理學(xué)試驗要求,新原料安全性毒理學(xué)試驗項目的選擇 ⑤ 微生物類新原料除按上述要求進行安全性毒理學(xué)試驗外，還應(yīng)進行以下試驗： 1）菌種毒力試驗； 2）耐藥性試驗； 3）有可能產(chǎn)生抗菌素、真菌毒素或其他活性物質(zhì)的菌種，應(yīng)進行

45、有關(guān)抗菌素、真菌毒素或其他活性物質(zhì)的檢測； 4）菌種代謝產(chǎn)物分析及其不產(chǎn)生有毒有害作用的試驗。,新原料安全性毒理學(xué)試驗要求,毒性試驗的劑量設(shè)計1、高劑量組應(yīng)出現(xiàn)毒性作用但不引起動物死亡，低劑量組應(yīng)不出現(xiàn)毒性作用，并求出未觀察到有害作用劑量（NOAEL）。2、若根據(jù)已掌握的資料（包括第一、二階段的毒性試驗及預(yù)試驗的結(jié)果等）判定新原料毒性較小，或人體推薦量較大，則試驗最高劑量應(yīng)為可給予的最大劑量（即：飼料中最大摻入量或最大灌胃濃度

46、下一次最大灌胃量）。,新原料安全性毒理學(xué)試驗要求,毒理學(xué)試驗結(jié)果新原料的未觀察到有害作用劑量（NOAEL）應(yīng)大于或等于人群可能攝入量的100倍；如果人體推薦攝入量較大，試驗中可給予的最大劑量小于人群可能攝入量的100倍，則在可給予的最大劑量下不應(yīng)觀察到有害作用。,第四部分,保健食品安全性毒理學(xué)評價中存在的問題,存在的問題,鑒于制訂此程序的歷史背景與目前情況有所不同，因此，對保健食品的安全性評價時，出現(xiàn)了選擇毒理試驗的項目、劑量、樣

47、品前處理等問題，現(xiàn)就上述問題一并提出供討論。,存在的問題,充分了解受試物1.要求提供規(guī)格化產(chǎn)品，至少是中試產(chǎn)品。符合既定的配方，生產(chǎn)工藝和質(zhì)量標準。2.仔細閱讀配方以了解受試物的物理、化學(xué)性質(zhì)（包括化學(xué)結(jié)構(gòu)、純度、穩(wěn)定性等）。3.了解生產(chǎn)工藝。4.按產(chǎn)品說明書的最大人體推薦量進行劑量設(shè)計。,存在的問題,動物年齡 主要指30天和90天喂養(yǎng)試驗，“程序”中規(guī)定用離乳大鼠，而保健食品應(yīng)視具體情況而異。最典型的是人參、鹿茸、減肥

48、產(chǎn)品，并非受試物本身有毒影響了動物的生長發(fā)育，而是因為這類產(chǎn)品的服用對象是成人，所用的動物是離乳大鼠。,存在的問題,實驗項目的選擇配方中含有僅限局部地區(qū)人群食用而又不在“51號”名單上的原料，只對產(chǎn)品進行了兩階段毒理試驗，而未對原料本身按要求進行毒理學(xué)評價，有的進行了評價但給予動物受試物的方式與實際食用方式不一樣，如袋泡茶摻在飼料中給予動物。含“51號”文附錄二名單上原料的產(chǎn)品只做了LD50和三項致空變試驗。,存在的問題,實驗項目的

49、選擇藥食同源產(chǎn)品經(jīng)有機溶劑提取未做毒理試驗，或只做LD50和微核試驗。從食品中提取某一成分的粗提物只做了LD50和三項致突變試驗，如大豆異黃酮。配方中僅有單一成分，如人參、西洋參、蜂王漿不必進行全部二階段毒理試驗。,存在的問題,樣品前處理（一）液體類（二）酒類（三）固體類（四）菌類（五）以某些食品為載體的保健食品：如富含微量元素的雞蛋、南瓜粉等,存在的問題,LD50中存在的問題 1.經(jīng)口LD50還用對照組。 2.

50、不寫禁食時間。 3.做到了21.5g/KgBW,結(jié)論是﹥10g/KgBW。 4.將受試物摻入飼料吃24小時。,存在的問題,Ames實驗 1.以油為載體的產(chǎn)品直接倒入平皿 2.工藝是低溫提取或低溫冷凍干燥的產(chǎn)品用8磅15分鐘高壓滅菌。 3.有溶劑對照而無自發(fā)回變對照。 4.菌落回變數(shù)隨劑量的增加而增多已超過正常值而不是二倍而出具了合格的報告,存在的問題,Ames實驗 5.有抑菌作用的產(chǎn)品不進行預(yù)試驗找出抑菌劑量

51、而出具了5mg/皿菌落回變數(shù)正常的報告。 6.產(chǎn)品中明顯含有組氨酸，而不進行除組氨酸的前處理。 7.應(yīng)該用XAD-2樹脂對樣品進行前處理 8.沒有理解5mg/皿含義：系指有效成份，如某些產(chǎn)品含有80%的糖，沒進行樣品前處理或向送樣方提出要求，直接用產(chǎn)品做5mg/皿，實際上是1mg/皿。,存在的問題,微核、精子畸形以及睪丸染色體畸變試驗 1.微核試驗：幾份報告中都有陽性對照的數(shù)據(jù)，而這幾份原始記錄中皆無陽性對照。 2.

52、精子畸形試驗：陽性對照組精子畸形率﹤3.4%，即判斷陰性對照組與陽性對照組相比差異有顯著性P﹤0.05。（正?；温蕿?.8-3.4%）。 3.睪丸染色體畸變試驗：陽性對照持續(xù)應(yīng)用一年以上。,存在的問題,30天或90天喂養(yǎng)實驗1.雌性鼠的體重比雄性鼠還重或一樣重,上表為SD大鼠正常體重,存在的問題,30天或90天喂養(yǎng)實驗2.食物利用率雌雄分不開，或為將雌、雄性大鼠食物利用率拉開差距，雌性和雄性大鼠的進食量基本一致。3.大鼠的進

53、食量越來越高，雌性大鼠700多克、 4.雄性大鼠600多克，而體重與食物利用率和以前的差不多。5.劑量設(shè)計：相當于推薦量（以g/Kg BW計）的6.56、26和105倍，這是先設(shè)計再做試驗，還是先做試驗再設(shè)計？6.受試物摻入飼料的量高達18%，袋泡茶摻入飼料給予動物。,存在的問題,30天或90天喂養(yǎng)實驗7.動物攝入飼料的量在30天喂養(yǎng)試驗以體重的10%計，90天喂養(yǎng)試驗以體重的8%計，這是經(jīng)過大量資料統(tǒng)計得出，但將受試物以10

54、-20%的濃度飲水給予動物，又不計飲水量，與報告的劑量設(shè)計是否基本一致？有的按每100gBw給10ml含有受試物的水，飲畢再給飲用水？8.有的試驗動物體重增長緩慢，解釋是受試物不好吃。9.生化指標：不做TG、AST；TC高達2.8mmol/L；BUN12.9mmol/L。,存在的問題,30天或90天喂養(yǎng)實驗10.以大鼠為試驗動物測尿酸，大鼠的代謝與人不完全一樣，可將尿酸轉(zhuǎn)化為尿囊素排出。11.病理報告：心肝脾無毒性損傷，兩個產(chǎn)品

55、，兩份報告來自同一檢測單位；A4紙寫了一大篇，詳細描述了病理組織結(jié)構(gòu)，沒有一點異常，四個產(chǎn)品、四份報告來源同一檢驗單位；寫一小段也比較詳細的描述了病理組織結(jié)構(gòu)，亦無任何異常三個產(chǎn)品、三份報告亦來源于同一檢驗單位。,存在的問題,傳統(tǒng)致畸試驗 其劑量設(shè)計比30天喂養(yǎng)還高，程序已明確以亞急性試驗的最大無作用劑量為高劑量，目的是：找強致畸物，即具有致畸作用，但無母體毒性出現(xiàn)，這種受試物致畸作用往往較強,存在的問題,其他典型問題

56、推薦量較大的產(chǎn)品，同一檢測單位，30天喂養(yǎng)試驗進行了樣品前處理達到足夠倍數(shù)，但LD50、三項致突變試驗未進行樣品前處理，相當于人推薦量的倍數(shù)很低；樣品進行了前處理但折合到樣品的量不一致；樣品進行了前處理，但報告中寫取一定量的樣品用回旋蒸發(fā)儀濃縮至所需濃度，劑量設(shè)計寫的是25、50、100ml/KgBw；有的報告要從字里行間為依據(jù)替檢測單位計算出劑量設(shè)計是否正確；Ames試驗的劑量以每皿百分之多少計。,第五部分,保健食品功能性檢驗及評價,

57、主要內(nèi)容,基本要求（一般程序） 動物功能學(xué)試驗基本要求 人體功能學(xué)試驗基本要求 各功能學(xué)試驗主要指標評審要求,保健食品功能評價的基本要求,1.對受試樣品的要求 提供樣品物理、化學(xué)性質(zhì)的有關(guān)資料 必須是規(guī)格化的定型產(chǎn)品 提供衛(wèi)生學(xué)和毒理學(xué)檢驗報告，樣品必須同一批次 提供功效成分和特征成分或營養(yǎng)成分的名稱及含量2.對受試樣品載體的要求 以乙醇和糖為載體的樣品必須提供乙醇和糖的含量,1.受試物 所提供的受

58、試物為組成成分、比例及純度與實際產(chǎn)品相同的樣品；必須在保質(zhì)期內(nèi)。2.受試物的預(yù)處理（具體方法同安全性毒理學(xué)評價） 處理方法需在試驗報告中詳細描述 必須說明受試物濃縮或稀釋倍數(shù)、濃度，據(jù)此計算出的給予劑量,動物功能學(xué)試驗基本要求,3.實驗動物、受試物給予方式及時間（1）實驗動物： 性別 單一性別 年齡 依試驗要求進行選擇 數(shù)量 大鼠每組8-12只 小鼠每組10-15

59、只 其余要求同安全性毒理學(xué)評價要求,動物功能學(xué)試驗基本要求,（2）受試物給予方式： 必須經(jīng)口給予，首選灌胃；若選擇飲水或摻入飼料，最高劑量不超過10％；提供每日每劑量組平均飲水量、食物攝入量及周食物利用率（3）給樣時間： 根據(jù)具體功能主要指標而定，7天-120天，一般為30天。,動物功能學(xué)試驗基本要求,4.劑量設(shè)計原則 （1）根據(jù)產(chǎn)品說明書注明的食用方法及用量，確定功能學(xué)試驗劑量設(shè)計是否合理。（2）進行動

60、物實驗時至少設(shè)三個劑量組，一個陰性對照組，必要時設(shè)陽性對照組或空白對照組。 以大鼠為實驗動物必須有相當于人體推薦量（折算為每公斤體重）的5倍劑量組。 以小鼠為實驗動物必須有相當于人體推薦量（折算為每公斤體重）的10倍劑量組。 最高劑量組不超過30倍，還必須在毒理學(xué)評價確定的安全劑量范圍內(nèi)。 當載體或輔料本身可能具有與受試物相同的功能時，應(yīng)設(shè)載體對照。,動物功能學(xué)試驗基本要求,人體功能學(xué)試驗基本要求,1.觀察對象的選擇 （1）合

61、理選擇受試者 按照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范（2003年）》規(guī)定的試驗對象納入與排除標準，并同時考慮試食設(shè)計要求、受試樣品的性質(zhì)等因素。（2）人數(shù) 試食組和對照組的有效例數(shù)不少于50人，且試驗的脫離率一般不得超過10%。試驗報告中必須注明脫離率，否則應(yīng)予以補充說明。（3）均衡性 試驗組間年齡、性別、社會狀況構(gòu)成、身體狀況以及試驗開始時各項功能主要指標均衡可比。,人體功能學(xué)試驗基本要求,2.

62、倫理學(xué)審查要點（1）保證受試對象的食用安全。 必須在衛(wèi)生學(xué)試驗、動物毒理學(xué)安全性試驗及興奮劑檢測（僅限改善生長發(fā)育、減肥功能)完成之后確定產(chǎn)品是安全的，符合有關(guān)衛(wèi)生標準要求的情況下再進行。 原則上還應(yīng)在動物功能學(xué)試驗證明其有效的前提下進行。注意： 報告中應(yīng)注明試驗開始日期和報告日期。開始時間應(yīng)晚于其它試驗報告時間。 如果試驗在不同單位進行的，必須提供同批號的受試樣品。 人體試驗必須得到檢查單位

63、倫理學(xué)審查委員會的批準方能進行，送審資料必須有審查委員的簽字。,人體功能學(xué)試驗基本要求,（2）受試者在試驗開始前應(yīng)進行常規(guī)體檢 主觀感覺 生理指標，癥狀和體征。 常規(guī)的血液學(xué)指標 生化指標 功效性指標，即與保健作用有關(guān)的指標，如抗氧化、減肥等方面的指標。 兒童一般不要求測心電圖、胸透、腹部B超及肝、腎功能項 改善生長發(fā)育、緩解視疲勞、輔助改善記憶功能不要求便常規(guī)，其他人體試驗便常規(guī)為必做項目。,人體功能學(xué)試驗基

64、本要求,（3）報告中需提供必要的體檢常規(guī)項目資料及詳細的數(shù)據(jù)。（4）對于選擇的受試人群需要長期服藥的試驗，受試者必須在服藥的基礎(chǔ)上進行試食試驗。（5）如需與醫(yī)院共同完成的試驗，必須選擇三級甲等醫(yī)院，報告中應(yīng)同時加蓋兩單位公章，同時需提供三級甲等醫(yī)院的等級證明。（6）改善生長發(fā)育和減肥功能的產(chǎn)品在人體功能試驗進行前需提供興奮劑檢測報告。,各功能試驗審評要點,（一）只要求動物實驗的項目有：1. 增強免疫力功能檢驗方法 主要指標

65、：細胞免疫功能 體液免疫功能 單核－巨噬細胞功能 NK細胞活性測定 判定：四項指標中任兩項結(jié)果陽性。 注意事項：不認可增強單項免疫力功能。,各功能試驗審評要點,2. 改善睡眠功能檢驗方法 主要指標：戊巴比妥納睡眠時間實驗 巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗 戊巴比妥鈉（或巴比妥鈉）閾下劑量催眠實驗

66、 判定：3項實驗中任2項陽性，且直接睡眠作用。 注意事項：對動物進行直接睡眠實驗時，也要同樣注意進 行30天灌胃。,各功能試驗審評要點,3. 緩解體力疲勞檢驗方法 主要指標：血乳酸 血清尿素 肝糖原/肌糖原 動物負重游泳實驗 判定：負重游泳實驗結(jié)果陽性，血乳酸曲線下面積、血清尿素、肝糖/肌糖原3項生化指標中任2項指標陽性。 注意事項：

67、 （1）對同批受試樣品進行違禁藥物的檢測。 （2）在負重游泳實驗時，酒類樣品測試當天可以不灌胃。,各功能試驗審評要點,4. 提高缺氧耐受力功能檢驗方法 主要指標：常壓耐缺氧實驗 亞硝酸鈉中毒存活實驗 急性腦缺血性缺氧實驗 判定：三項試驗中任二項實驗結(jié)果陽性。 注意事項：每批實驗動物的體重盡量保持一致。,各功能試驗審評要點,5. 對輻射危害有輔助保護功能檢驗

68、方法 主要指標：外周血白細胞計數(shù) 骨髓細胞DNA含量或骨髓有核細胞數(shù) 小鼠骨髓細胞微核實驗 血/組織中SOD活性實驗 血清溶血素含量實驗 判定：以上5項實驗中任3選項進行實驗，3項實驗中任何2項實驗結(jié)果陽性。 注意事項：選用小鼠，受試樣品于照射前給予14～30天，照射后仍然給予受試物，必要時可延至45天。,各功能試驗