第六章微生物的遺傳和變異

1、第六章微生物的遺傳和變異,,主要內容：,核酸的基本化學組成與結構微生物的遺傳微生物的變異基因重組遺傳工程技術,●1868年，F(xiàn). Miescher從細胞核中分離得到一種酸性物質，即現(xiàn)在被稱為核酸的物質。,,第一節(jié) 核酸的基本化學組成與結構,,核酸,核苷酸,核苷,磷酸,堿基,戊糖,,元素組成： C H O N P,核酸完全水解產(chǎn)生嘌呤和嘧啶等堿性物質、戊糖（核糖或脫氧核糖）和磷酸的混合物。核酸部分水解則產(chǎn)生核苷和

2、核苷酸。每個核苷分子含一分子堿基和一分子戊糖，一分子核苷酸部分水解后除產(chǎn)生核苷外，還有一分子磷酸。核酸的各種水解產(chǎn)物可用層析或電泳等方法分離鑒定。,,組成核酸的戊糖有兩種。DNA所含的糖為 β-D-2-脫氧核糖；RNA所含的糖則為β-D-核糖。,一、戊糖,二、堿基,1. 嘌呤（Purine）,2. 嘧啶（Pyrimidine）,,核酸中也存在一些不常見的稀有堿基。稀有堿基的種類很多，大部分是上述堿基的甲基化產(chǎn)物。,,三、核苷（n

3、ucleoside）,核苷 戊糖+堿基 糖與堿基之間的C-N鍵，稱為C-N糖苷鍵,假尿苷（ψ）次黃苷（肌苷）I黃嘌呤核苷 X二氫尿嘧啶核苷 D取代核苷的表示方式7-甲基鳥苷 m5G,Adenosine Guanosine Cytidine Uridine,四、核苷酸（nucleotide） 核苷酸 核苷+磷酸 戊糖+堿基+磷酸,五、核苷

4、酸衍生物,1. 繼續(xù)磷酸化,2.環(huán)化磷酸化,cAMP,cGMP,3. 肌苷酸及鳥苷酸(強力味精),4. 輔酶 NAD、NADP、FMN,,IMP GMP,六、多聚核苷酸（核酸）,多聚核苷酸是通過一個核苷酸的C3’-OH 與另一分子核苷酸的5’-磷酸基形成3’,5’-磷酸二酯鍵相連而成的鏈狀聚合物。,5′-磷酸端（常用5’-P表示）；3

5、′-羥基端（常用3’-OH表示）多聚核苷酸鏈具有方向性，當表示一個多聚核苷酸鏈時，必須注明它的方向是5′→3′或是3′→5′。,多聚核苷酸的表示方式,DNA RNA,5′PdAPdCPdGPdTOH 3′ 5′PAPCPGPUOH ′ 或5′ACGTGCGT 3′

6、 5′ACGUAUGU 3′ ACGTGCGT ACGUAUGU,98％核中（染色體中） 真核 線粒體（mDNA） 核外 葉綠體（ctDNA）DNA 擬核

7、 原核 核外：質粒（plasmid） 病毒：DNA病毒,核酸分為兩大類： 脫氧核糖核酸 Deoxyribonucleic Acid （DNA） 核糖核酸 Ribonucleic Acid（RNA）,RNA主要存在于細胞質中,轉運RNA ( tRNA) t-RNA約占細胞總RNA的10～15％，也稱之為“受體RNA”。核糖體RNA （ rRNA） r-R

8、NA約占細胞總RNA的80％，是核糖體的核酸。 信使RNA （mRNA） m-RNA約占細胞總RNA的5％左右，為單鏈結構，不同細胞的m-RNA的鏈長和分子量的差異很大。,第二節(jié) 微生物的遺傳,遺傳和變異的物質基礎——DNA,▲40年代發(fā)現(xiàn)了生物的遺傳物質是DNA 1928年Griffith經(jīng)典的轉化實驗； 1941年Avery的轉化補充實驗； 1952年Hersey何Chase大腸桿菌T2噬菌體感染大腸桿菌試驗；

9、 證明DNA是生物的遺傳物質基礎。,,,,,■ DNA的結構與復制,50年代弄清了DNA的雙螺旋結構,1953年Watson和Crick建立了DNA的雙螺旋結構模型—1957年諾貝爾生理學獎。,▲ DNA的結構,（Francis Crick,1916-2004)（右）和沃森(James Watson,1928-),DNA雙螺旋結構,,,■DNA雙螺旋結構的特點,DNA分子由兩條DNA單鏈組成。DNA的雙螺旋結構是分子中兩條DNA單鏈之

10、間基團相互識別和作用的結果。雙螺旋結構是DNA二級結構的最基本形式。,三股螺旋結構的DNA,DNA的存在形式,基因——遺傳因子 基因：是一切生物體內儲存遺傳信息的、有自我復制能力的遺傳功能單位。它是DNA分子上一個具有特定堿基順序、即核苷酸序列的片斷。 基因按功能分三種： ①結構基因 ②操縱基因 ③調節(jié)基因,,60年該確定了遺傳信息的傳遞方式,1961年J.Monod和F.Jacob提出了操縱子學說；,■遺傳信

11、息的傳遞,1966年Nireberg破譯了遺傳密碼，敘述了中心法則；,,,基因工程的誕生理論上的三大發(fā)現(xiàn),▲DNA的復制,■DNA的變性和復性DNA變性,,,■DNA復性,變性DNA在適當?shù)臈l件下，兩條彼此分開的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結構，這一過程稱為復性。DNA復性后，一系列性質將得到恢復，但是生物活性一般只能得到部分的恢復。DNA復性的程度、速率與復性過程的條件有關。將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時，DNA不可能復性。但

12、是將變性的DNA緩慢冷卻時，可以復性。分子量越大復性越難。濃度越大，復性越容易。此外，DNA的復性也與它本身的組成和結構有關。,■DNA復性,,,■ RNA RNA一級結構的特點,tRNA一級結構tRNA分子具有以下特點：分子量25000左右，大約由70－90個核苷酸組成，沉降系數(shù)為4S左右。分子中含有較多的修飾成分。3'-末端都具有CpCpAOH的結構。,mRNA一級結構,真核細胞mRNA的3‘-末端有一段長達200

13、個核苷酸左右的聚腺苷酸(polyA)，稱為 “尾結構” ，5’ -末端有一個甲基化的鳥苷酸，稱為” 帽結構“ 。,rRNA,動物細胞核糖體rRNA有四類：5SrRNA，5.8SrRNA，18SrRNA，28SRNA。許多rRNA的一級結構及由一級結構推導 出來的二級結構都已闡明，但是對許多rRNA的功能迄今仍不十分清楚。,tRNA的高級結構,1，tRNA的二級結構tRNA的二級結構都呈” 三葉草” 形狀，在結構上具有某些共同之處，

14、一般可將其分為五臂四環(huán)：包括氨基酸接受區(qū)、反密碼區(qū)、二氫尿嘧啶區(qū)、T?C區(qū)和可變區(qū)。除了氨基酸接受區(qū)外，其余每個區(qū)均含有一個突環(huán)和一個臂。,2,tRNA的三級結構,在三葉草型二級結構的基礎上，突環(huán)上未配對的堿基由于整個分子的扭曲而配成對，目前已知的tRNA的三級結構均為倒L型,轉錄,,微生物生長與蛋白質合成,RNA與生物遺傳信息的表達-蛋白質合成,首先，DNA通過轉錄作用，將其所攜帶的遺傳信息（基因）傳遞給 mRNA, 在三種 RNA（

15、mRNA、tRNA和rRNA）的共同作用下，完成蛋白質的合成。,轉錄過程,翻譯過程,現(xiàn)在已經(jīng)知道作為多肽合成起始信號的密碼子有兩個，即甲硫氨酸的密碼子(AUG)和氨酸的密碼子(GUG)(極少出現(xiàn))。在大腸桿菌中, 起始密碼子AUG 所編碼的氨基酸并不是甲硫氨酸本身, 而是甲酰甲硫氨酸。,,,第三節(jié) 微生物的變異,變異的實質——基因突變,基因突變,上述DNA堿基順序的改變，是DNA在復制過程中出現(xiàn)錯誤產(chǎn)生的。由于DNA是具有復制功能的分子

16、，一旦DNA堿基順序出錯，它就會通過復制機制遺傳下去。由于DNA堿基順序的改變引起生物遺傳性狀顯著變化的現(xiàn)象，稱為基因“突變”。,■突變的類型,自發(fā)突變 ▲多因素低劑量的誘變效應 ▲互變異構效應誘發(fā)突變 ▲物理誘變 ▲化學誘變 ▲復合處理及其協(xié)同效應 ▲定向培育和馴化,(1) DNA分子中堿基互變異構,DNA分子的堿基，存在酮式—烯醇式或氨式—亞胺式互變異構。不同的互變異構體形成氫鍵的方向和能力不同，有可能導致復制時

17、出現(xiàn)錯誤。例如在正常情況下，A（氨式結構）與T（酮式結構）配對；當A以亞胺式存在時（幾率非常?。?，則與C配對。,(2) 物理因素,能夠引起基因突變的物理因素主要包括：紫外線（UV）、高能射線和電離輻射等。,當DNA受到大劑量紫外線（波長260nm附近）照射時，可引起DNA鏈上相鄰的兩個嘧啶堿基共價聚合，形成二聚體，例如TT二聚體。,,光聚合反應,胸腺嘧啶堿基在紫外光照射下，可以發(fā)生二聚加成反應：

18、 在DNA分子中，如果兩個胸腺嘧啶堿基相鄰，在紫外光照射下，可能發(fā)生上述聚合反應，其結果是破壞了正常復制或轉錄。,X-射線以及放射性物質產(chǎn)生的輻射具有很高的能量，能直接引起DNA物理或化學性質的改變。另外，電離輻射將也能使DNA周圍環(huán)繞的其它分子（主要是水）產(chǎn)生具有很高活性的自由基，這些自由基能夠進一步與DNA分子反應，導致DNA結構發(fā)生變化。,(3) 化學因素,化學因素是引起DNA結構發(fā)生變化的最常見因素，主要包括：烷

19、基化試劑，亞硝酸鹽以及堿基類似物等。烷基化試劑能夠與DNA分子中的氨基或氧作用，生成烷基化DNA。除了堿基上有多個位置可被烷基化外，DNA鏈上磷酸二酯鍵中的氧也容易被烷基化，從而導致DNA鏈的斷裂。,烷基化反應,由于含氧堿基存在酮式和烯醇式的互變異構，烯醇式中的羥基可以被烷基化轉變?yōu)榉€(wěn)定的烯醇醚。鳥嘌呤核苷烷基化形成6-甲氧基鳥嘌呤核苷后，不再與C配對，而與T配對。這種情況將引起DNA的復制、轉錄及信息表達出現(xiàn)錯誤。,環(huán)外氨基的反

20、應,環(huán)外氨基在適當條件下，也可以發(fā)生化學反應。胞嘧啶核苷在亞硝酸作用下，可以形成重氮鹽，再轉變?yōu)槟蜞奏ず塑?。因此生物體內亞硝酸的存在有可能改變DNA的堿基組成。腺嘌呤核苷和鳥嘌呤核苷也能發(fā)生類似的反應，分別形成次黃嘌呤核苷（I）和黃嘌呤核苷（X）。這種變化，將影響或改變堿基形成氫鍵的能力和方向，導致DNA復制錯誤，是引起基因突變的重要原因之一。,堿基類似物是一類結構與核酸堿基相似的人工合成或天然化合物，由于它們的結構與核酸的

21、堿基相似，當這些物質進入細胞后能夠摻入到DNA鏈中，干擾DNA的正常復制和轉錄。常見的有堿基衍生物及稠環(huán)、稠雜環(huán)類化合物。例如5-溴尿嘧啶（5-BU），它與胸腺嘧啶堿基的結構相似，能取代T與A配對。又如一種稱為二惡英的含氯芳香雜三環(huán)化合物（2,3,7,8-四氯-二苯-二惡英，簡稱TCDD），是一種具有強烈致癌和致畸物質。它能夠進入細胞并與DNA結合，導致DNA復制發(fā)生錯誤，從而可能誘發(fā)癌變。,2. DNA損傷修復,光復活切除修復

22、重組修復SOS修復,光復活（photoreactivation）,可見光（最有效波長400nm）激活生物界廣泛分布（高等哺乳動物除外）的光復活酶，該酶分解嘧啶二聚體。是一種高度專一的修復形式，只分解由于UV照射而形成的嘧啶二聚體。,切除修復（excision repair）,即在一系列酶的作用下，將DNA分子中受損傷的部分切除掉，并以完整的那一段為模板，合成出切去的部分，從而使DNA恢復正常。這是一種比較普遍的修復機制。細胞的修復

23、功能對于保護遺傳物質DNA不受破壞有重要意義。,重組修復（recombination repair）,又稱復制后修復（postreplication repair）受損傷的DNA在進行復制時，跳過損傷部位，在子代DNA鏈與損傷相對應部位出現(xiàn)缺口。通過分子間重組，從完整的母鏈上將相應的堿基順序片段移至子鏈的缺口處，然后再用合成的多核苷酸來補上母鏈的空缺，此過程即重復修復。并非完全校正。,SOS修復,指DNA受到嚴重損傷、細胞處于危急狀態(tài)

24、時所誘導的一種DNA修復方式，修復結果只是能維持基因組的完整性，提高細胞的生成率，但留下的錯誤較多，又稱傾錯性修復（Error-Prone Repair ）。,第三節(jié) 基因重組,雜交： 是通過雙親細胞的融合，使整套染色體的基因重組，或者是通過雙親細胞的溝通，使部分染色體基因重組。轉化： 受體細胞直接吸收來自供體細胞得DNA片斷，并把它整合到自己的基因組里，從而獲得了供體細胞部分遺傳性狀的現(xiàn)象。,,通過溫和噬菌體的媒介作用，

25、把供體細胞內特定的基因（DNA片斷）攜帶至受體細胞中，使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。,轉導,第四節(jié) 遺傳工程技術在環(huán)境工程中的應用,遺傳工程技術在環(huán)境工程中的應用,■質粒育種: 將兩種或多種微生物通過細胞結合或融合技術，使供體菌的質粒轉移到受體內，使受體菌保留自身功能質粒，同時獲得供體菌的功能質粒，即培育出具有兩種功能質粒的新品種。 ▲多功能超級細菌的構建； ▲工程菌的構建；,,,改變細胞內的關鍵酶或酶系統(tǒng)：隨著工業(yè)

26、發(fā)展，大量的合成有機化合物進入環(huán)境，其中很大部分難于生物降解或降解緩慢，只是在環(huán)境中的停留時間長達數(shù)年至數(shù)十年?；蚬こ虨樵摳淖兗毎麅鹊年P鍵酶或酶系統(tǒng)提供了可能，從而可以：提高微生物的降解速率；拓寬底物的專一性范圍；維持低濃度下的代謝活性；改善有機污染物降解過程中的生物催化穩(wěn)定性；,,設計復合代謝途徑； 2，4，6-三硝基甲苯（TNT）； 假單胞菌可以利用TNT為唯一碳源，但不能利用甲苯； 將具有甲苯完整降

27、解途徑的TOL質粒pWO-Km導入該微生物，可以擴展微生物的代謝能力，構建的新微生物可以是TNT完全降解。,,拓寬氧化酶的專一性； 三氯乙烯(TCE)某些氧化酶可以進攻該分子，但氧化速率低；甲苯雙氧化酶對TCE具有部分活性，但催化過程中易失活；而聯(lián)苯雙氧化酶不能氧化，而基因工程構建的雜和聯(lián)苯雙氧化酶體系可以氧化TCE，且其氧化速度為天然甲苯雙合氧化酶的3倍；且穩(wěn)定性更好，在環(huán)境污染物降解方面有大作為。,,增強無機磷的去除：

28、活性污泥只能去除城市廢水中20%-40%無機磷， 有些細菌能夠以聚磷酸鹽形式過量積累磷，通過對E.coli polyP激酶基因ppK和再生ATP乙酸激酶基因ackA進行擴增，可以有效的提高E.coli對無機磷的去除能力2-3倍，4h將0.5mol/L的磷酸鹽去除約90%。 此結果顯示，通過基因工程改進酶的活性，在無機污染物如磷的處理方面也大有潛力。,■基因工程技術,技術上的三大發(fā)明：●工具酶 1970年Smith和Wi

29、lcox從流感嗜血桿菌中分離并純化了限制性核酸內切酶HindⅡ，使DNA分子的切割成為可能。 1967年世界上5個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶，使DNA裂口的修復成為可能。,,● 載體 大多數(shù)DNA片斷不具備自我復制的能力，為了使它們能夠在宿主細胞中進行繁殖，必須將DNA片斷接到一種特定的，具有自我復制能力的DNA分子上，這種DNA分子就是基因工程載體（vector）。 可作為基因載體的有： 病毒；噬菌體；質粒等不同

30、小分子量的復制子。 最常用的是抗藥性R因子質粒分子pBR322和pUC13。,●逆轉錄酶 1970年Baltimore等人同時發(fā)現(xiàn)了逆轉錄酶，打破了中心法則，使真核基因的制備成為可能。 具備了以上的理論和技術基礎，基因工程誕生的條件已經(jīng)成熟。 1972年斯坦福大學的P.Berg等人在世界上第一次實現(xiàn)了DNA體外重組。 猿猴病毒SV40DNA+λ噬菌體DNA---→重組DNA分子； 1973年斯坦福大學地S.Coh

31、en成功地進行了另一個體外重組DNA實驗并成功地實現(xiàn)了細菌間性狀的轉移。 大腸桿菌抗四環(huán)素質粒pSC101+抗新霉素質粒R6-3 ---→重組DNA分子----→大腸桿菌（篩選出了抗四環(huán)素和抗新霉素的重組菌落 基因工程從此誕生了。,●基因工程的內容,帶有目的基因的DNA片斷的獲??；在體外將目的基因片斷連接到載體分子上，形成重組分子；重組分子導入受體細胞；帶有重組DNA分子的細胞擴增，獲得大量的細胞繁殖群體;重組體的篩選；