吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物

1、第十四章 臨床免疫檢驗(yàn)自動(dòng)化分析,免疫檢驗(yàn)自動(dòng)化 （automation of immunoassays) 是將免疫學(xué)反應(yīng)檢測(cè)過(guò)程中的取樣、加試劑、混合、溫育、固相載體分離、信號(hào)檢測(cè)、數(shù)據(jù)處理、打印報(bào)告和檢測(cè)后的儀器清洗等步驟由計(jì)算機(jī)控制，自動(dòng)化進(jìn)行。,20世紀(jì)50-80年代:免疫學(xué)檢測(cè)主要是手工操作20世紀(jì)80年代末:隨著單克隆抗體技術(shù)、免疫標(biāo)記技術(shù)以及計(jì)算機(jī)技術(shù)的出現(xiàn)，自動(dòng)化免疫分析技術(shù)引入臨床提高檢測(cè)靈敏度，增加檢測(cè)項(xiàng)目

2、縮短檢測(cè)時(shí)間提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確度和準(zhǔn)確度,自動(dòng)化免疫分析儀的共同特點(diǎn),計(jì)算機(jī)系統(tǒng),樣本處理系統(tǒng),自動(dòng)稀釋自動(dòng)進(jìn)樣自動(dòng)清洗,主機(jī)系統(tǒng),溫育反應(yīng)系統(tǒng),信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng),信號(hào)處理及數(shù)字轉(zhuǎn)換,信號(hào)儲(chǔ)存分析報(bào)告,,,,,,,,,,,試劑系統(tǒng),,免疫自動(dòng)化儀器分析技術(shù),第一節(jié) 免疫濁度測(cè)定的自動(dòng)化分析第二節(jié) 發(fā)光免疫測(cè)定的自動(dòng)化分析第三節(jié) 熒光免疫測(cè)定的自動(dòng)化分析第四節(jié) 酶聯(lián)免疫測(cè)定的自動(dòng)化分析,第一節(jié)免疫濁度測(cè)定的

3、自動(dòng)化分析,免疫濁度分析的基本原理是：抗原、抗體在特定的電解質(zhì)溶液中反應(yīng)，形成小分子免疫復(fù)合物（19S），使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。在抗體稍微過(guò)量且固定的情況下，形成的免疫復(fù)合物量隨抗原量的增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增大，即待測(cè)抗原量與反應(yīng)溶液的濁度呈正相關(guān)。,自動(dòng)化免疫濁度分析,一定波長(zhǎng)的入射光線通過(guò)抗原抗體反應(yīng)后的溶液時(shí)，被其中的免疫復(fù)合物微粒吸收、反射和折射而減弱，在一定范圍內(nèi)，吸光度與免疫復(fù)合物量呈正相關(guān)，而形成的免疫復(fù)合物量與參與

4、反應(yīng)的抗原和抗體的量呈正相關(guān)。與已知濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品比較，可確定標(biāo)本中抗原含量。,一、免疫透射比濁法,,（一）原理：,1.將待檢標(biāo)本和抗原參考品作適當(dāng)稀釋。,（二）儀器工作過(guò)程,2.將待測(cè)標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液（5個(gè)濃度抗原標(biāo)準(zhǔn)品）與適當(dāng)過(guò)量的抗血清混合，在一定條件下，抗原抗體反應(yīng)完成后，在340nm處測(cè)定各管吸光度。,3.按log-logit轉(zhuǎn)換或y=ax3+bx2+cx+d方程進(jìn)行曲線擬合，制備劑量-反應(yīng)曲線，由計(jì)算機(jī)處理，計(jì)算出抗原濃

5、度。,（三）方法評(píng)價(jià),優(yōu)點(diǎn): 靈敏度高，穩(wěn)定性好，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確,不足: ①抗體用量較大； ②溶液中存在的抗原－抗體復(fù)合物分子應(yīng)足夠大 ③透射比濁測(cè)定在抗原－抗體反應(yīng)的第二階段，檢 測(cè)需在抗原抗體反應(yīng)達(dá)到平衡后進(jìn)行，耗時(shí)較長(zhǎng)。,用抗體致敏的大小適中、均勻一致的膠乳顆粒（一般為0.2 μm），在遇到相應(yīng)抗原時(shí)，膠乳顆粒上的抗體與抗原特異結(jié)合，引起膠乳顆粒凝聚 ，使透射光和散射光即出現(xiàn)顯著變化。如圖所示：a為單個(gè)膠乳顆

6、粒不阻礙光線透過(guò)，b為抗原抗體結(jié)合形成的凝聚膠乳大顆粒使透射光減弱或散射光增強(qiáng)。,二、免疫膠乳比濁法,（一）原理：,（二）方法評(píng)價(jià),本法敏感度大大高于普通比濁法，可達(dá)ng/L水平，操作簡(jiǎn)便，易自動(dòng)化；血清中的類風(fēng)濕因子(RF)可與IgG Fc段結(jié)合，使IgG致敏膠乳顆粒出現(xiàn)非特異性凝集，用F(ab’)2片段代替IgG既可消除此干擾，又可克服IgG致敏膠乳的自凝現(xiàn)象；免疫膠乳輕度自凝或抗體活性降低會(huì)嚴(yán)重影響結(jié)果。,粒子對(duì)光線的散射作用是溶

7、液中的微粒子受到光線照射后，微粒子對(duì)光線產(chǎn)生反射和折射而形成散射光。懸浮微粒對(duì)光散射形成的散射光強(qiáng)度與微粒的大小、數(shù)量、入射光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度、測(cè)量角度等因素密切相關(guān)，其公式如下：,三、免疫散射比濁法,原理,式I θ中為與入射光成θ角處散射光強(qiáng)度；λ和I0為入射光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度；dn/dc為校正因子，反映了溶液折射指數(shù)和顆粒濃度的變化；M為顆粒分子量；c為濃度；N為阿佛加德指數(shù)；γ為顆粒到檢測(cè)器的距離；θ為散射光與入射光的夾角（散射夾角）。,

8、Iθ＝　I0［4π2（dn/dc) 2 Mc(1+cosθ)］ Nγ2λ4,兩種散射：Rayleigh-散射（顆粒直徑入射光波長(zhǎng):不均勻散射） 大多數(shù)蛋白質(zhì)分子直徑比光波長(zhǎng)小很多，因而只產(chǎn)生Rayleigh-散射Rayleigh散射：散射光的強(qiáng)度與復(fù)合物的量呈正比、與入射光波長(zhǎng)成反比。,散射顆粒與散射光,散射免疫比濁分析時(shí)一定要保持抗體過(guò)量，以維持抗原抗體復(fù)合物的相

9、對(duì)不溶解性；測(cè)定的散射信號(hào)值應(yīng)在曲線的上升臂部位，濁度信號(hào)與待測(cè)抗原量呈正比。,定時(shí)散射比濁法速率散射比濁法,免疫散射比濁法,定時(shí)散射比濁法是在保證抗體過(guò)量的情況下，加入待測(cè)抗原，此時(shí)反應(yīng)立即開(kāi)始，在反應(yīng)的第一階段，溶液中產(chǎn)生的散射光信號(hào)波動(dòng)較大，所獲取的信號(hào)計(jì)算出的結(jié)果會(huì)產(chǎn)生一定的誤差。定時(shí)散射比濁法是避開(kāi)抗原抗體反應(yīng)的不穩(wěn)定階段，即散射光信號(hào)在開(kāi)始反應(yīng)7.5s～2min內(nèi)的第一次讀數(shù)，專門在抗原抗體反應(yīng)的最佳時(shí)段進(jìn)行讀數(shù)，將檢測(cè)

10、誤差降到最低。,(一)定時(shí)散射比濁法（fixed time nephelometry）,1. 儀器測(cè)定技術(shù)要點(diǎn),檢測(cè)分兩時(shí)間進(jìn)行：①預(yù)反應(yīng)階段----加少量樣本與抗體反應(yīng)，測(cè)定第一次散射光信號(hào)（7.5-120s）；②反應(yīng)階段----加入全量待測(cè)樣本，4分鐘內(nèi)測(cè)定第二次散射光信號(hào)。第二次散射光信號(hào)作為待測(cè)抗原與抗體形成復(fù)合物顆粒產(chǎn)生的信號(hào)峰值，經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件處理轉(zhuǎn)換為待測(cè)抗原濃度。,2. 抗原過(guò)量檢測(cè),(1) 抗體適當(dāng)過(guò)量 　(2)

11、 對(duì)抗原過(guò)量進(jìn)行閾值限定,定時(shí)散射比濁法測(cè)定原理示意圖,速率散射比濁法是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)測(cè)定法。連續(xù)測(cè)定各時(shí)間復(fù)合物形成的速率與其產(chǎn)生的散射光信號(hào)聯(lián)系在一起，形成動(dòng)態(tài)的速率散射比濁法，每項(xiàng)檢測(cè)僅1～2min即可完成。,(二)速率散射比濁法（rate nephelometry）,速率-----指抗原抗體結(jié)合反應(yīng)過(guò)程中，每一單位時(shí)間內(nèi)兩者結(jié)合的速度。,抗原抗體復(fù)合物形成表,基本原理：抗原與相應(yīng)抗體以一定比例混合后，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)

12、，免疫復(fù)合物的總量逐漸增加，而速率的變化由慢－快－慢，反應(yīng)時(shí)間最快的某一時(shí)刻稱為速率峰。當(dāng)反應(yīng)液中的抗體量保持過(guò)剩時(shí)，速率峰的高低與抗原含量成正比，儀器自動(dòng)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線將速率峰值轉(zhuǎn)化為所測(cè)抗原的終濃度。,速率散射比濁原理圖,儀器測(cè)定技術(shù)要點(diǎn),開(kāi)啟機(jī)器，進(jìn)行定標(biāo) 反應(yīng)階段 抗原過(guò)量檢測(cè),圖20-6　抗原抗體反應(yīng)散射光峰值的動(dòng)態(tài)變化,抗原過(guò)量檢測(cè),(三)散射比濁方法評(píng)價(jià),散射比濁法是目前臨床應(yīng)用較多的一種方法，本法自動(dòng)化程度高，具有快速

13、、靈敏、準(zhǔn)確、精密等優(yōu)點(diǎn)。采用抗原過(guò)量檢測(cè)方法，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。但儀器和試劑價(jià)格比較貴, 對(duì)抗體的質(zhì)量要求很高。,1.抗原抗體比例 　2.抗體的質(zhì)量 　3.增濁劑的使用,（一）免疫比濁分析的影響因素,免疫比濁分析的影響因素和臨床應(yīng)用,4.偽濁度 5.入射光光源和波長(zhǎng) 6.結(jié)果報(bào)告中的計(jì)量單位 7.標(biāo)準(zhǔn)曲線制備與質(zhì)量控制,（二）臨床應(yīng)用,免疫比濁分析法主要用于檢測(cè)免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、κ鏈、λ鏈、免疫

14、球蛋白亞類；補(bǔ)體C3、C4；血漿蛋白如前白蛋白(PAB)、白蛋白(ALB)、α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)、β2-微球蛋白(β2-MG)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)、銅藍(lán)蛋白(CER)、結(jié)合珠蛋白(HP)、，C-反應(yīng)蛋白(CRP)、載脂蛋白ApoAI、ApoB、脂蛋白(a)、類風(fēng)濕因子(RF)、尿微量蛋白系列和某些治療性藥物濃度等。,第二節(jié)發(fā)光免疫測(cè)定的自動(dòng)化分析,三大經(jīng)典標(biāo)記技術(shù),放射免疫技術(shù),酶免疫技術(shù),發(fā)光免疫技術(shù),1.樣本盤2.試劑盤

15、3.溫育反應(yīng)系統(tǒng)4.固相載體清洗和分離系統(tǒng)5.信號(hào)產(chǎn)生和檢測(cè)系統(tǒng)6.計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理和控制系統(tǒng),自動(dòng)化發(fā)光免疫分析系統(tǒng)的組成,發(fā)光:是指分子或原子中的電子吸收能量后，由基態(tài)（較低能級(jí)）躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級(jí)），然后再返回到基態(tài)，并釋放光子的過(guò)程。根據(jù)形成激發(fā)態(tài)分子的能量來(lái)源不同可分為:光照發(fā)光、生物發(fā)光、化學(xué)發(fā)光等。,基本概念,化學(xué)發(fā)光:化學(xué)能光照發(fā)光(熒光):光能,激發(fā)能不同:,化學(xué)發(fā)光（chemiluminescence

16、）是指伴隨化學(xué)反應(yīng)過(guò)程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象。某些物質(zhì)(發(fā)光劑)在化學(xué)反應(yīng)時(shí)，吸收了反應(yīng)過(guò)程中所產(chǎn)生的化學(xué)能，使反應(yīng)的產(chǎn)物分子或反應(yīng)的中間態(tài)分子中的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時(shí)，以發(fā)射光子的形式釋放出能量，這一現(xiàn)象稱為化學(xué)發(fā)光。,化學(xué)發(fā)光,在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物，稱為化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物。,化學(xué)發(fā)光劑,㈠直接化學(xué)發(fā)光劑 直接化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過(guò)程中不需酶的催化作用，直

17、接參與發(fā)光反應(yīng)，它們?cè)诨瘜W(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特有基團(tuán)，可直接標(biāo)記抗原或抗體。,1. 吖啶酯 在堿性條件下被H2O2氧化時(shí),發(fā)出波長(zhǎng)為470nm的光，具有很高的發(fā)光效率，其激發(fā)態(tài)產(chǎn)物　N-甲基吖啶酮是該發(fā)光反應(yīng)體系的發(fā)光體。,,N-甲基吖啶酮,2．三聯(lián)吡啶釕 三聯(lián)吡啶釕 [RU(bpy)3]2+是電化學(xué)發(fā)光劑，它和電子供體三丙胺（TPA）在陽(yáng)電極表面可同時(shí)失去一個(gè)電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。,三聯(lián)吡啶釕,電化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)原理,㈡ 酶促反應(yīng)發(fā)

18、光劑： 是利用標(biāo)記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底 物）發(fā)光，這一類需酶催化后發(fā)光的發(fā)光劑 稱為酶促反應(yīng)發(fā)光劑。,1．魯米諾及其衍生物 2．金剛烷衍生物（AMPPD）,,1．魯米諾,魯米諾發(fā)光原理,,2．AMPPD〔3-(2‘-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷〕〕,分類：直接偶聯(lián)：通過(guò)偶聯(lián)反應(yīng)使標(biāo)志物分子中反應(yīng)基團(tuán)直接連接到被標(biāo)志物分子的反應(yīng)基團(tuán)上。間接偶聯(lián)：用功能交聯(lián)劑在標(biāo)志物分

19、子和被標(biāo)志物之間插入一條鏈或一個(gè)基團(tuán)，使兩種物質(zhì)通過(guò)“橋”連接成結(jié)合物。優(yōu)點(diǎn)：增加反應(yīng)活性，減弱空間位阻效應(yīng)。,發(fā)光劑的標(biāo)記技術(shù),被標(biāo)志物保持自身的特性（抗體特性），又具有標(biāo)志物特性（發(fā)光/催化發(fā)光）,1. 碳二亞胺（EDC）縮合法,,,2. 過(guò)碘酸鈉氧化法,3．重氮鹽偶聯(lián)法,4. N-羥基琥珀酰亞胺活化法,,化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型：,一：直接化學(xué)發(fā)光免疫分析二：化學(xué)發(fā)光酶免疫分析1.辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光2.堿性磷酸酶標(biāo)記

20、的化學(xué)發(fā)光三、電化學(xué)發(fā)光免疫分析,一、直接化學(xué)發(fā)光免疫分析,用吖啶酯直接標(biāo)記抗體(抗原)，與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)只需加入氧化劑（H2O2）和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光 。 由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，這部分光的積分與待測(cè)抗原的量成正比，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測(cè)抗原的含量。,,,,,,,,,

21、,Y,,Y,,Y,Y,,Y,Y,,Y,Y,Y,Y,Y,,,,,Y,,順磁性微粒示意圖,磁微粒技術(shù),磁微粒在電磁場(chǎng)中分離,磁微粒標(biāo)記抗體,發(fā)光,Y,Y,,Y,,,磁微粒,,被測(cè)抗原,+,抗體,+,,帶吖啶酯標(biāo)記物抗體,,,,,,,沖洗后,,,--- 夾心法,（1）加入H2O2（pH<10）,,,,（2）加入堿（pH>10）,,直接化學(xué)發(fā)光的機(jī)理,吖啶酯標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀是一種用發(fā)光劑直接標(biāo)記抗體或抗原的一類免疫

22、分析法。該儀器利用化學(xué)發(fā)光技術(shù)和磁性微粒子分離技術(shù)，以吖啶酯為化學(xué)發(fā)光劑，以細(xì)小的順磁性微粒為固相載體。其測(cè)定原理有雙抗體夾心法、雙抗原夾心法和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合法等。,吖啶酯標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析儀,儀器測(cè)定技術(shù)要點(diǎn),抗原抗體結(jié)合 洗滌、分離 加入氧化劑發(fā)光 信號(hào)檢測(cè),,吖啶酯標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定示意圖,吖啶酯標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析方法學(xué)評(píng)價(jià),反應(yīng)簡(jiǎn)單快速，不需要催化劑發(fā)光迅速，背景噪音低，敏感性高吖啶酯直接標(biāo)記抗體發(fā)光時(shí)間短，對(duì)信號(hào)

23、檢測(cè)儀要求高,化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme 　immunoassay，CLEIA）是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶如辣根過(guò)氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶(ALP)來(lái)標(biāo)記抗原或抗體，在與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，加入底物(發(fā)光劑)，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)并加以放大，再把它們

24、傳送至計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計(jì)算出測(cè)定物的濃度。,二、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析,,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖,㈠ 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析,該儀器采用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗原或抗體、以塑料錐形小管為固相載體，魯米諾為化學(xué)發(fā)光劑，還利用增強(qiáng)劑使化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增加、時(shí)間延長(zhǎng)。,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀,抗原抗體結(jié)合 洗滌、分離 加入信號(hào)試劑A和氧化劑B 信號(hào)檢測(cè),儀器測(cè)定技術(shù)要點(diǎn),辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)

25、記的化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定示意圖,,堿性磷酸酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖,㈡ 堿性磷酸酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析,,堿性磷酸酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀,該儀器是以堿性磷酸酶標(biāo)記抗原或抗體，以順磁性微粒子為固相載體，用AMPPD作為化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行測(cè)定的自動(dòng)化儀器。,抗原抗體結(jié)合 洗滌、分離 加入AMPPD發(fā)光劑 信號(hào)檢測(cè),儀器測(cè)定技術(shù)要點(diǎn),堿性磷酸酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定示意圖,化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法學(xué)評(píng)價(jià),測(cè)定過(guò)程與ELISA相似，僅

26、最后一步酶反應(yīng)的底物改為發(fā)光劑和測(cè)定的儀器為光信號(hào)檢測(cè)儀酶標(biāo)記抗原或抗體結(jié)合穩(wěn)定酶催化魯米諾、AMPPD等發(fā)光劑發(fā)出的光穩(wěn)定，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，便于記錄和測(cè)定,（三）堿性磷酸酶標(biāo)記的微粒子熒光免疫分析儀,該儀器以堿性磷酸酶標(biāo)記抗原或抗體，以塑料微粒為固相載體包被抗體（或抗原），以4-甲基傘型酮磷酸鹽（4-MUP）作為酶促反應(yīng)的熒光基質(zhì)（底物），底物被酶水解后，脫磷酸根基團(tuán)，形成4-甲基傘型酮(4-MU)，用360nm激發(fā)光照射，發(fā)出450

27、nm的熒光。,4-甲基傘型酮磷酸鹽（4-MUP）反應(yīng)原理示意圖,儀器測(cè)定技術(shù)要點(diǎn),抗原抗體結(jié)合 洗滌、分離 加入底物4-MUP 信號(hào)檢測(cè),堿性磷酸酶標(biāo)記的微粒子熒光免疫測(cè)定示意圖,電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA）是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過(guò)程。電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀是采用電化學(xué)發(fā)光技術(shù)，生物素放大技術(shù)，以順磁性微粒為固相載體，用三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗原或抗體，三丙胺(TPA)為電子供體，而

28、設(shè)計(jì)的一種自動(dòng)化分析儀器。電化學(xué)發(fā)光穩(wěn)定、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，易于控制并可根據(jù)待測(cè)分子的大小設(shè)計(jì)成多種反應(yīng)模式如夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法等。,三、 電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀,三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3] 2+分子結(jié)構(gòu)圖,電化學(xué)發(fā)光劑發(fā)光的反應(yīng)原理,磁性微粒直徑2.8µm，表面的凸凹使包被面積放大。磁性微粒體積小，懸浮于反應(yīng)體系中，形成均一穩(wěn)定的液相，在磁場(chǎng)中易于分離。,,,儀器測(cè)定技術(shù)要點(diǎn),抗原抗體結(jié)合 電化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 光信號(hào)檢測(cè) 檢測(cè)完畢

29、,,電化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖,電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定工作示意圖,標(biāo)記磁顆粒在電場(chǎng)中發(fā)光工作示意圖,電化學(xué)發(fā)光免疫分析方法學(xué)評(píng)價(jià),三聯(lián)吡啶釕在電場(chǎng)中因不斷得到TPA提供的電子，可周而復(fù)始發(fā)光，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，信號(hào)強(qiáng)度高；三聯(lián)吡啶釕直接標(biāo)記抗原或抗體，結(jié)合穩(wěn)定，不影響標(biāo)志物的理化特性試劑靈敏度高、穩(wěn)定性好,四、在臨床免疫檢測(cè)中的應(yīng)用,無(wú)論是直接化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定、化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定和電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定，目前都是采用發(fā)光技術(shù)和免疫反應(yīng)與計(jì)算機(jī)技術(shù)完

30、美結(jié)合的自動(dòng)化儀器分析。智能化程度高，敏感度高、特異性強(qiáng)、精密度和準(zhǔn)確性均高于RIA，特別是檢測(cè)靈活性高、快速、檢測(cè)試劑穩(wěn)定并易于進(jìn)行質(zhì)量控制。目前已趨替代RIA而成為免疫檢測(cè)廣泛采用的技術(shù)。隨著新開(kāi)發(fā)的試劑盒不斷推出，其檢測(cè)的項(xiàng)目越來(lái)越多：如內(nèi)分泌激素、腫瘤標(biāo)志物、心肌標(biāo)志物、病毒類標(biāo)志物、血藥濃度、骨代謝和貧血等。,第三節(jié) 熒光免疫測(cè)定的自動(dòng)化分析,熒光免疫自動(dòng)化分析主要是將抗原—抗體結(jié)合反應(yīng)與熒光物質(zhì)發(fā)光分析和計(jì)算機(jī)技術(shù)有機(jī)

31、結(jié)合的一項(xiàng)自動(dòng)化免疫分析技術(shù)。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)后是否需要進(jìn)行固相分離，分為均相和非均相兩類。非均相熒光免疫測(cè)定主要有時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定法；均相熒光免疫測(cè)定主要有熒光偏振免疫測(cè)定法。,時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（time resolved fluorescence immunoassay, TRFIA）是以鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體作為示蹤物，并與時(shí)間分辨測(cè)定技術(shù)相結(jié)合，建立起來(lái)的一種新型非放射性微量分析技術(shù)，具有靈敏度高，鑭系元素發(fā)光穩(wěn)定，熒光

32、壽命長(zhǎng)，不受樣品自然熒光干擾，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬等特點(diǎn)，已在臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛使用。,一、時(shí)間分辨熒光免疫分析儀,自發(fā)熒光壽命短:1ns～10ns鑭系元素壽命長(zhǎng):10μs～1000μs短壽命熒光完全衰變后再測(cè)定鑭系元素特異熒光,（一）基本原理,,時(shí)間分辨檢測(cè)原理示意圖,時(shí)間分辨,Eu3+元素激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間的stokes位移,（二）、stokes位移,Eu3+抗體－抗原復(fù)合物在反應(yīng)液中經(jīng)激發(fā)后的熒光信號(hào)較弱，必須加入一種增強(qiáng)液(enh

33、ancement solution)，使Eu3+抗體－抗原復(fù)合物的PH值降低至2~3，以利于Eu3+從復(fù)合物上完全解離下來(lái)，游離的Eu3+為增強(qiáng)液中的另一種螯合劑所螯合，在協(xié)同劑等其它成分的作用下，與增強(qiáng)液中的β-二酮體生成一個(gè)Eu3+在其內(nèi)部的保護(hù)性膠態(tài)分子團(tuán)，這是一個(gè)新的具有高強(qiáng)度熒光的穩(wěn)定螯合物，它在紫外光的激發(fā)下發(fā)射很強(qiáng)的熒光，信號(hào)的增強(qiáng)效果可達(dá)上萬(wàn)倍，該技術(shù)使用了解離增強(qiáng)步驟，并且采用了前后兩種不同的螯合劑，前一種用于Eu3+

34、與抗體標(biāo)記，后一種用于與解離下來(lái)的Eu3+螯合成新的強(qiáng)熒光發(fā)射分子，因此，又將該技術(shù)稱為解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖?dissociation-enhanced lanthanide fluoroimmunoassay, DELFIA),（三）解離增強(qiáng)原理：,（四）儀器測(cè)定技術(shù)要點(diǎn),⒈ 抗原抗體結(jié)合 ?、?加入Eu3+螯合抗體 　⒊ 加入酸性增強(qiáng)液 　4. 信號(hào)檢測(cè),固相雙抗體夾心TRFIA檢測(cè)過(guò)程示意圖,,1. TRFIA分析用的

35、酸性增強(qiáng)液易受環(huán)境、試劑、容器等里面的鑭系元素污染，使本底升高，所用試劑和器材應(yīng)盡量防塵。 　2.TRFIA分析用載體最常用的是聚苯乙烯微96孔板，其熒光本底低，并有洗滌微孔板的自動(dòng)裝置，但不同廠家生產(chǎn)的微孔板，所產(chǎn)生的熒光有很大差異，應(yīng)選擇應(yīng)用。,（五）注意事項(xiàng),熒光偏振免疫測(cè)定　(fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA)，為一種均相熒光免疫測(cè)定方法，其利用熒光物質(zhì)在溶液中被單一平面的偏

36、振光照射后，可吸收光能而產(chǎn)生另一單一平面的偏振發(fā)射熒光，該熒光強(qiáng)度與熒光 標(biāo)記物質(zhì)在溶液中旋轉(zhuǎn)的速度呈反比，與分子大小呈正比，常采用抗原-抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)原理，適用于小分子半抗原（如藥物濃度）的檢測(cè)。,二、熒光偏振免疫分析儀,基本原理,抗原抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)AgF分子小，轉(zhuǎn)動(dòng)速度快，偏振熒光弱 AgF-Ab分子大，轉(zhuǎn)動(dòng)速度慢，偏振熒光強(qiáng) 若待檢抗原多，則AgF-Ab少，AgF多，偏振熒光弱待檢抗原含量與偏振熒光強(qiáng)度成反比,偏振光和偏振熒光

37、發(fā)生示意圖,熒光偏振免疫測(cè)定工作原理示意圖,1. 抗原抗體反應(yīng) 　2.偏振熒光強(qiáng)度測(cè)定,（二） 儀器測(cè)定技術(shù)要點(diǎn),1.FPIA的結(jié)果好壞取決于熒光素標(biāo)記的好壞、激發(fā)態(tài)熒光的平均壽命、抗原的相對(duì)分子量和復(fù)合物的特性等因素?！?.為提高FPIA靈敏度，可用除蛋白劑對(duì)標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理，除去干擾成分。,（三）注意事項(xiàng),自動(dòng)化熒光免疫分析的應(yīng)用,1. 激素：甲狀腺激素、甾體類激素 2. 病毒性肝炎標(biāo)志物 3. 腫瘤相關(guān)抗原 4. 小分子藥

38、物 5. 多肽類,第四節(jié) 自動(dòng)化酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng),根據(jù)全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)的處理模式，人們通常將全自動(dòng)酶免分析儀分成二類，一類為分體機(jī)，一類為連體機(jī)。分體機(jī)是由“前處理系統(tǒng)”即全自動(dòng)樣本處理工作站和“后處理系統(tǒng)”即全自動(dòng)酶免分析儀兩個(gè)獨(dú)立的部分組成。連體機(jī)是由多個(gè)模塊組成，使用一臺(tái)計(jì)算機(jī)、一套操作系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了從標(biāo)本稀釋、加樣到酶標(biāo)板孵育、洗滌、加試劑、再孵育、洗滌、讀數(shù)和結(jié)果打印全自動(dòng)進(jìn)行。,（一）儀器組成和性能,1.條形碼識(shí)別系統(tǒng)

39、　2.樣本架和加樣系統(tǒng) 　3.試劑架 　4.溫育系統(tǒng),5.液路系統(tǒng) 　6.洗板系統(tǒng) 　7. 酶標(biāo)板讀數(shù)儀 　8.自動(dòng)裝載傳遞系統(tǒng) 　9. 計(jì)算機(jī)管理和信息系統(tǒng),全自動(dòng)酶免分析儀中的連體機(jī)是將樣本處理工作站和全自動(dòng)酶免分析儀聯(lián)合起來(lái)，工作速度快，自動(dòng)化程度高，適合大批量樣本的處理。分體機(jī)，由于它有一個(gè)獨(dú)立的全自動(dòng)樣本處理站，加樣速度快，適合試驗(yàn)項(xiàng)目變化多、樣本批量不等的臨床實(shí)驗(yàn)室。,（二）儀器評(píng)價(jià),采用流水線式操作,自動(dòng)化

40、分析的選擇與應(yīng)用,一、選擇原則- 資質(zhì)- 性能- 環(huán)境條件- 檢測(cè)要求- 信息要求- 經(jīng)濟(jì)效益二、臨床應(yīng)用,免疫濁度分析,免疫檢驗(yàn)自動(dòng)化,定時(shí)散射比濁法,速率散射比濁法,散射比濁法,透射比濁法,化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng),熒光免疫分析系統(tǒng),自動(dòng)化酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng),直接化學(xué)發(fā)光免疫分析,化學(xué)發(fā)光酶免疫分析,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光,堿性磷酸酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光,電化學(xué)發(fā)光免疫分析,時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定,熒光偏振免疫測(cè)定,,,,