一些苯乙烯代謝物的檢測(cè)和它們的毒性作用研究.pdf

1、苯乙烯（Styrene，CAS：100-42-5）是塑料橡膠工業(yè)的重要原料，苯乙烯可發(fā)生聚合反應(yīng)生成聚苯乙烯，或與其他單體原料形成共聚物，用以制造各種塑料樹(shù)脂，合成橡膠。含有苯乙烯的塑料橡膠制品廣泛用于日常生活和工業(yè)生產(chǎn)，如各種包裝材料、隔熱材料、一次性飯盒、紙杯、管道、容器等。苯乙烯每年產(chǎn)量巨大，全球產(chǎn)量達(dá)3000多萬(wàn)噸，我國(guó)2005年產(chǎn)量達(dá)125萬(wàn)噸。苯乙烯還存在于某些植物、煙草和汽車尾氣中。職業(yè)暴露是最有可能引起毒性的情況。作業(yè)環(huán)

2、境中的苯乙烯主要以氣體形式通過(guò)呼吸道，或通過(guò)皮膚接觸進(jìn)入人體。短時(shí)間接觸高濃度苯乙烯可引起咳嗽、咽痛等呼吸道刺激癥狀。長(zhǎng)時(shí)間接觸苯乙烯可引起肺組織結(jié)構(gòu)損害，從而使工人易患肺炎、肺氣腫等疾病。苯乙烯是可疑致癌物，但在人體內(nèi)的致癌性還存在爭(zhēng)議。 苯乙烯在小鼠，大鼠和人體內(nèi)外均可發(fā)生代謝反應(yīng)，且存在很大的物種間差異，其中小鼠對(duì)苯乙烯的代謝速率最快，其次為大鼠和人。苯乙烯經(jīng)體內(nèi)P450酶代謝后主要生成苯乙烯環(huán)氧化物（Styrene o

3、xide，SO），苯乙烯環(huán)氧化物有較強(qiáng)的氧化性，可引起脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷。苯乙烯環(huán)氧化物同時(shí)也是親電化合物，可與蛋白質(zhì)、核酸等親核生物大分子形成共價(jià)結(jié)合物，引起蛋白質(zhì)功能的改變和基因突變，從而引起細(xì)胞損傷．苯乙烯還可發(fā)生苯環(huán)羥基化代謝，生成羥基苯乙烯，為苯環(huán)乙烯的次要代謝途徑。 本文從以下三部分研究?jī)?nèi)容進(jìn)行深入探討，為進(jìn)一步研究苯乙烯的致毒機(jī)理打下基礎(chǔ)。 1．LC/ESI-MS方法檢測(cè)苯乙烯及1，3-丁二烯

4、代謝物 苯乙烯和1，3-丁二烯是塑料和橡膠工業(yè)廣泛使用的原料。它們主要通過(guò)P450酶代謝成為相應(yīng)的環(huán)氧化物，即苯乙烯環(huán)氧化物和3-丁烯-1，2-環(huán)氧化物，環(huán)氧化物通過(guò)環(huán)氧化物水解酶或自發(fā)水解成為相應(yīng)的二醇，即苯乙二醇和3-丁烯-1，2-二醇。二醇代謝物可以作為苯乙烯和1，3-丁二烯暴露的生物標(biāo)志物。然而苯乙二醇和3-丁烯-1，2-二醇很難在質(zhì)譜的ESI離子源內(nèi)有效離子化，所以無(wú)法用ESI-MS檢測(cè)。而且苯乙二醇和3-丁烯-1，

5、2-二醇紫外吸收強(qiáng)度低，最大吸收波長(zhǎng)在低波長(zhǎng)處，紫外檢測(cè)易受到干擾。我們開(kāi)發(fā)了柱前衍生化方法用LC/ESI-MS方法測(cè)定苯乙二醇和3-丁烯-1，2-二醇。利用二醇能和硼酸生成硼酸酯的原理，用2-溴吡啶-5-硼酸作為衍生化試劑，使二醇容易離子化，實(shí)現(xiàn)苯乙二醇和3-丁烯-1，2-二醇的ESI-MS檢測(cè)。2．溴吡啶-5-硼酸分子內(nèi)含有氮元素，可是促進(jìn)正離子模式下的離子化；2-溴吡啶-5-硼酸含有溴元素，溴元素有天然的兩個(gè)同位素，因此衍生化產(chǎn)物

6、也有兩個(gè)同位素，在質(zhì)譜上表現(xiàn)出兩個(gè)相互重疊的同位素離子峰，有利于辨別干擾。該衍生化方法操作步驟簡(jiǎn)便、快速，不但提高了靈敏度，而且可以鑒別二醇化合物。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)2-溴吡啶-5-硼酸衍生化其他二醇的能力，我們選取了四個(gè)含有不同羥基構(gòu)象的二醇化合物，測(cè)定了它們和2-溴吡啶-5-硼酸的親和力，發(fā)現(xiàn)二醇的構(gòu)型很大程度上影響到硼酸酯的生成。在環(huán)己烷二醇中，順式二醇比反式構(gòu)型的有更強(qiáng)的親和力，而且環(huán)的剛性會(huì)影響親和力。 2．苯乙烯環(huán)氧化

7、物蛋白結(jié)合物立體選擇性抗體的制備 苯乙烯對(duì)人和動(dòng)物有肺毒性和肝臟毒性。苯乙烯環(huán)氧化物是主要的致毒代謝中間產(chǎn)物，它能和蛋白質(zhì)如白蛋白和血紅蛋白發(fā)生共價(jià)結(jié)合。苯乙烯環(huán)氧化物有兩個(gè)光學(xué)異構(gòu)體，而且有報(bào)道R型的苯乙烯環(huán)氧化物比S型的毒性大。我們制備了能夠立體選擇性的識(shí)別苯乙烯環(huán)氧化物半胱氨酸殘基共價(jià)結(jié)合物的多克隆抗體，通過(guò)將苯乙烯環(huán)氧化物對(duì)映體分別和巰基化的鑰孔帽貝血藍(lán)蛋白（Keyhole limpet hemocyanin，KLH）

8、結(jié)合制備免疫用抗原．通過(guò)用免疫抗原免疫家兔制備得到多克隆抗體。ELISA結(jié)果顯示6只家兔都產(chǎn)生了針對(duì)苯乙烯環(huán)氧化物牛血清白蛋白的抗體，和牛血清白蛋白BSA沒(méi)有交叉反應(yīng)．3只用R-抗原免疫的家兔產(chǎn)生的抗血清都有較好立體選擇性，而只有1只用S-抗原免疫的家兔有立體選擇性。我們進(jìn)一步用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA和免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了抗體的立體選擇性，抗體可以識(shí)別WI-38細(xì)胞經(jīng)苯乙烯環(huán)氧化物暴露后的蛋白結(jié)合物。而且應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA和競(jìng)爭(zhēng)性免疫印跡方法

9、研究發(fā)現(xiàn)，手性中心的羥基是免疫識(shí)別所必須的．用Western blot分析了細(xì)胞暴露于苯乙烯后的細(xì)胞總蛋白，發(fā)現(xiàn)苯乙烯環(huán)氧化物與蛋白的共價(jià)結(jié)合缺乏選擇性。 3．4-羥基苯乙烯在苯乙烯致毒過(guò)程中的作用 苯乙烯的苯環(huán)羥基化是苯乙烯代謝的另一條途徑，為苯乙烯的次要代謝途徑。在苯乙烯暴露的工人尿液中可以檢測(cè)到4-羥基苯乙烯（4-VP）。在小鼠和大鼠的苯乙烯體內(nèi)代謝研究中都發(fā)現(xiàn)了4-VP。4-VP占苯乙烯代謝的比例較小，根據(jù)報(bào)

10、道，在小鼠中4-VP代謝物占苯乙烯總尿液代謝物的6％，大鼠中占1％，人中小于0．1％。但4-VP的體內(nèi)毒性比SO大。4-VP苯乙烯致毒過(guò)程中的地位如何，目前還沒(méi)有定論。我們通過(guò)比較苯乙烯和4-氟取代苯乙烯的體內(nèi)外毒性和它們的代謝來(lái)研究4-VP在苯乙烯致毒的過(guò)程中的作用，結(jié)果顯示，1）：苯乙烯和4-氟苯乙烯的體內(nèi)外毒性在均同一水平；2）在小鼠肝微粒體中，苯乙烯苯環(huán)羥基化產(chǎn)物有2-，3-和4-羥基苯乙烯，而4-氟苯乙烯沒(méi)有檢測(cè)到苯環(huán)羥基化產(chǎn)