體外單倍體誘導和單倍體育種

1、體外單倍體誘導與單倍體育種,體外單倍體誘導通常是指利用離體培養(yǎng)花藥或小孢子的方法，誘導形成單倍體植株。單倍體育種是指將具有單套染色體的單倍體植物，經(jīng)人工染色體加倍，使其成為純合二倍體，從中篩選出優(yōu)良個體，直接繁育成新品種；或選出具有單一優(yōu)良性狀的個體，作為雜交育種的原始材料[1]。,,,,,,,,,,1,2,3,4,5,6,7,8,9,花柄,花托,子房,花萼,花瓣,花柱,柱頭,花藥,花絲,,雄蕊,,,,雌蕊,（花冠）,花粉植株形態(tài)發(fā)生

2、的方式,愈傷組織型：離體培養(yǎng)的花粉粒先形成愈傷組織，再分化為單倍體植株水稻花藥的培養(yǎng),接種在平板上的水稻花藥,部分花藥產(chǎn)生愈傷組織,類胚體型：離體培養(yǎng)的花粉粒分裂后，以胚狀體的形式釋放出來，然后發(fā)育成植物體,部分花藥通過胚狀體途徑形成小植株,煙草花藥培養(yǎng),通過胚狀體途徑再生形成小植株,煙草花藥培養(yǎng),13.1 植物小孢子發(fā)育過程,第一期，小孢子母細胞減數(shù)分裂形成四分體。四分體的周圍包裹著一層厚的胼胝質(zhì)，隨著胼胝質(zhì)的分解四個小孢子便分離開

3、來；第二期，單個小孢子繼續(xù)發(fā)育。進行第一次花粉細胞有絲分裂，分裂是不對稱的，這種類型的花粉粒稱為A型；第三期，小孢子發(fā)育形成成熟的花粉粒。標志：細胞中明顯出現(xiàn)兩個核。,花藥培養(yǎng):將花粉發(fā)育至一定階段的花藥培養(yǎng)在人工培養(yǎng)基上，誘導其花粉粒改變發(fā)育進程，形成花粉胚或愈傷組織，進而分化成苗的過程[2]。（器官培養(yǎng)） 花粉培養(yǎng)(小孢子培養(yǎng))：將發(fā)育至一定階段花粉從花藥中分離出來成為分散或游離狀態(tài)，花粉脫分化后再生成苗。（細胞培養(yǎng)）,

4、13.2 花藥和花粉培養(yǎng)：,歷史：,Guha和Maheshwari （1964） 曼陀羅花藥培養(yǎng)Nitsch 和 Norreel (1973) 煙草花粉培養(yǎng)（游離小孢子培養(yǎng)） Chu（1973）小麥花粉培養(yǎng) （早期花藥培養(yǎng)主要依靠小孢子的自然胚胎發(fā)生產(chǎn)生單倍體，能自發(fā)形成胚胎發(fā)生的基因頻率較低，效率極低）80年代后期到90年代期間，花培技術(shù)迅速發(fā)展。許多作物小孢子培養(yǎng)已經(jīng)成功。十字花科、麥類、水稻、玉米等[3]。90年代

5、，一些先前被認為是不易進行小孢子培養(yǎng)的基因型也相繼成功Konzak (1999) 。,花藥和花粉培養(yǎng)：指在合成培養(yǎng)基上，改變花粉的發(fā)育途徑，使其不形成配子，而像體細胞一樣進行分裂、分化、最終發(fā)育成完整植株。該發(fā)育途徑被稱為“花粉孢子體發(fā)育途徑”或“雄核發(fā)育”[4]。兩者的異同點培養(yǎng)目的相同，均獲得小孢子植株?；ㄋ幣囵B(yǎng)屬于器官培養(yǎng)；而花粉培養(yǎng)屬于細胞培養(yǎng)?；ǚ叟囵B(yǎng)沒有藥壁組織干擾；可計數(shù)小孢子產(chǎn)胚率；可觀察雄核發(fā)育的全過程；單倍體

6、產(chǎn)量高。但技術(shù)更復(fù)雜。,2. 花藥或花粉培養(yǎng)的意義：,2.1 作物育種（1）縮短育種周期：常規(guī)育種需4-6年獲得純系，而小孢子培養(yǎng)僅需一年。,例子：二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基因為AAbb的純合單株常規(guī)方法： AAbb出現(xiàn)的概率為1/16，并且不能將AAbb與Aabb、aAbb區(qū)分開。,（2）提高了目標基因型的選擇效率,ABaBAbabABAABBAaBBAABbAaBbaBaABBa

7、aBBaABbaaBbAbAabBAabBAAbbAabbabaAbBaabBaAbbaabb,例子：二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基因為AAbb的純合單株單倍體方法： AAbb出現(xiàn)的概率為1/4。,（2）提高了目標基因型的選擇效率,植株不受顯隱性的影響，在誘變育種中能在當代及時獲得突變個體，加倍后成為穩(wěn)定的純系。,（3）誘變育種中的作用,2.2 物種進化研究 可探索親本染色體組的構(gòu)成

8、。分析單倍體植物減數(shù)分裂時，形成二價體的數(shù)目和形狀，能確定染色體組內(nèi)是否存在同源染色體。 2.3 遺傳分析 單倍體植株中基因不受顯隱性的影響，每一個基因的作用均能表現(xiàn)出來。能用來研究基因的性質(zhì)及其作用。還可用于基因的劑量效應(yīng)分析[5]。2.4 構(gòu)建連鎖圖譜 雙單倍體（DH）群體是永久性群體，能有效地用于遺傳圖譜的構(gòu)建2.5 用于遺傳轉(zhuǎn)化 能直接表達外源基因，不受顯隱性影響。,3. 花粉孢子體發(fā)育途徑

9、 （雄核發(fā)育）,3.1 花粉發(fā)育的階段,花粉離體培養(yǎng)時，雄核發(fā)育最適宜的時期一般是第一次有絲分裂或之前。,3.2 雄核發(fā)育途徑,1、A途徑 小孢子第一次有絲分裂為均等分裂，形成營養(yǎng)細胞和生殖細胞 （1）A-V途徑 由營養(yǎng)細胞重復(fù)分裂形成單倍體 （2）A-G途徑 由生殖細胞重復(fù)分裂形成單倍體 （3）A-VG途徑（E途徑） 由營養(yǎng)細胞和生殖細胞各自獨立分裂，共同形成單倍體 （4）C途徑

10、 營養(yǎng)細胞和生殖細胞通過核融合，形成多倍體植株2、B途徑 小孢子第一次有絲分裂為均等分裂，形成大小相近的兩個細胞。然后由這兩細胞邊續(xù)分裂形成單倍體植株，或者核融合形成多倍體植株,1、雄核發(fā)育與P花粉的形成P-花粉：具胚胎發(fā)生潛能的花粉。也稱小花粉（S-花粉）或不染色花粉（NS-花粉）2、雄核發(fā)育與饑餓處理饑餓處理改變了小孢子的配子體發(fā)育方向，啟動雄核發(fā)育。,3.3 雄核發(fā)育啟動機理,,1、胚狀體發(fā)育途徑

11、 小孢子經(jīng)歷胚發(fā)生的各個階段，最后子葉展開，形成花粉植株。2、愈傷組織發(fā)育途徑 小孢子分裂數(shù)次形成愈傷，再分化形成花粉植株。此途徑產(chǎn)生的植株會出現(xiàn)變異且倍性復(fù)雜[6]。,,3.4 花粉植株形態(tài)發(fā)生方式,4 花藥和花粉培養(yǎng)方法,4.1 花藥培養(yǎng),1、取材 鏡檢，根據(jù)花粉的發(fā)育時期，選取大小適宜的花蕾。 2、消毒 70％酒精擦洗花蕾表面，或70％酒精浸泡30-60s后在1％次氯酸鈉溶液中浸泡10-2

12、0min或在0.1％的氯化汞溶液中消毒3-10min，無菌水沖洗3-5次。 3、培養(yǎng) 固體或液體培養(yǎng)基均可。先進行脫分化培養(yǎng)，至小孢子大量分裂形成胚或愈傷，并突破花藥壁表面，形成突出物（2-3周）；后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，形成小植株[7]。,4.2 花粉培養(yǎng),(一)花粉的分離與純化 1、自然散落法(漂浮培養(yǎng)散落小孢子收集法) 將花藥接種在預(yù)處理液或液體培養(yǎng)基上，待花粉自動散落后，收集培養(yǎng)。2、擠壓法 在燒杯

13、或研缽中擠壓花藥，將花粉擠出后收集培養(yǎng)。3、機械游離 （1）磁攪拌法 用磁力攪拌器攪拌培養(yǎng)液中的花藥，使花粉游離出來；（2）超速旋切法 通過攪拌器中的高速旋轉(zhuǎn)刀具破碎花蕾、穗子、花藥，使小孢子游離出來（此法應(yīng)用最廣）。4、小孢子純化 對上述方法獲得的小孢子混合物進行分級過篩、梯度離心處理純化小孢子,梯度離心前（小孢子形態(tài)、活力不一致）,30%蔗糖梯度離心后（獲得均一的小孢子群體）,(二)花粉培

14、養(yǎng)方式 1、平板培養(yǎng) 花粉置瓊脂固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。2、液體培養(yǎng) 花粉懸浮在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，需震蕩，以利通氣。3、雙層培養(yǎng) 花粉置固體-液體雙層培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)基制作方法：先鋪一層瓊脂固體培養(yǎng)基，凝固后，在表面加入少量液體培養(yǎng)基。 4、看護培養(yǎng) 利用花藥或花藥愈傷組織釋放出的活性物質(zhì)促進花粉小孢子發(fā)育。5、微室培養(yǎng) 利用小的蓋玻片和凹穴載玻片形成微室進行花粉培養(yǎng)6

15、、條件培養(yǎng)基培養(yǎng) 利用培養(yǎng)過花藥的液體培養(yǎng)基或含失活花藥提取物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。花藥條件培養(yǎng)基、子房條件培養(yǎng)等。,看護培養(yǎng)圖解,其操作方法是在固定培養(yǎng)基上置入一塊活躍生長的愈傷組織，再在愈傷組織上放一小片濾紙，待濾紙濕潤后將細胞接種于濾紙上。當培養(yǎng)細胞長出微小細胞團以后，將其直接轉(zhuǎn)移至瓊脂培養(yǎng)基上讓其迅速生長。,一、倍性鑒定,1、染色體直接計數(shù)法 通常取根尖、莖尖等分生組織區(qū)進行制片，直接計數(shù)染色體數(shù)目

16、。2、間接鑒定（1）掃描細胞光度儀鑒定（流式細胞儀） 主要測定葉片單個細胞中DNA的含量確定細胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。（2）細胞形態(tài)學鑒定法 葉片保衛(wèi)細胞大小、單位面積上的氣孔數(shù)及保衛(wèi)細胞中葉綠體的大小和數(shù)目與倍性具有高度的相關(guān)性。（3）植株形態(tài)學鑒定法 單倍體植株瘦弱，葉片窄小，花小柱頭長，花粉粒小，不結(jié)實[8]。,4.3 單倍體植株鑒定和染色體加倍,（4）雜交鑒定法自交或測交鑒定

17、，看后代分離情況確定二倍體植株是來自小孢子還是體細胞。（5）分子標記鑒定包括生化標記（如同工酶標記）和分子標記（如RFLP、RAPD、AFLP等）,4.3 單倍體植株鑒定和染色體加倍,二、染色體加倍,（一）莖段培養(yǎng)將單倍體植株的莖段進行培養(yǎng)，誘導愈傷組織形成。由于單倍體愈傷組織在培養(yǎng)過程中會有一定頻率的核內(nèi)有絲分裂，從而形成二倍體細胞，分化出純合的二倍體植株。,4.3 單倍體植株鑒定和染色體加倍,二、染色體加倍,（二）化學試

18、劑誘變有秋水仙素、Oryzalin、trifluralin、APM等。1、秋水仙素誘導（1）浸泡法無菌條件下以一定濃度的秋水仙素浸泡再生小植株，再轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。（2）生長錐處理 秋水仙素水溶液直接涂抹生長點（頂芽或腋芽）。（3）培養(yǎng)基處理 將單倍體植株和任何一部分作為外植體，種植在附加一定濃度和秋水仙素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，轉(zhuǎn)入無秋水仙素的相同培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)誘導胚狀體。2、除草劑誘導

19、（毒性小，引起植株的變異幾率?。?4.3 單倍體植株鑒定和染色體加倍,花藥和花粉培養(yǎng)基本流程：,,5. 影響雄核發(fā)育和花粉花藥培養(yǎng)的因素,（一）基因型 植物基因型是影響雄核發(fā)育的最重要的因素之一。同一物種中的不同基因型對小孢子離體誘導反應(yīng)差異較大。 如在水稻中，秈稻花粉培養(yǎng)力遠低于糯稻。,（二）供體植株生長條件和生理狀態(tài)1、植株生長條件 光溫等因素均能影響花藥培養(yǎng)力。一般處于適宜生長

20、條件（如溫室中）較好。但物種間存在差異。2、植株生長時期 一般是開花始期優(yōu)于開花末期。3、P花粉的頻率 不同溫度、日照時數(shù)、氮饑餓及生長物質(zhì)處理提高P花粉的數(shù)量,（三）花粉發(fā)育時期小孢子發(fā)育時期對誘導雄核發(fā)育非常重要。,四分體: 醋酸洋紅染色,四分體: Alexander’s 染色,單核期,雙核期,成熟花粉粒,處于不同發(fā)育時期的煙草小孢子,單核晚期,?液泡,第一次有絲分裂后期,雙核早期,雙核中期,?

21、生殖核,?生殖核,營養(yǎng)核?,（四）預(yù)處理 預(yù)處理是小孢子培養(yǎng)成功的前提條件 預(yù)處理目的：是改變小孢子的發(fā)育方向，使盡可能多的小孢子從配子體發(fā)育途徑轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育途徑（即成為具胚胎發(fā)生潛力的小孢子）。適當?shù)念A(yù)處理能使綠苗產(chǎn)量大量增加。 預(yù)處理方法：主要是對花藥進行適度的逆境處理，包括低溫、高溫、化學物質(zhì)、離心、射線等[9]。,1、高低溫處理低溫預(yù)處理：指在接種之前將材料用0℃以上低溫處理一段時間后再接種。應(yīng)用較多。處理溫度

22、一般在1-14℃，時間從幾小時至幾十天不等。不同作物所用的預(yù)處理溫度及時間差異較大。不同的處理溫度需要不同的時間。 例子:小麥穗子培養(yǎng)前4℃預(yù)處理幾天，花藥培養(yǎng)效率顯著提高。 十字花科未經(jīng)低溫預(yù)處理的花蕾，每花藥產(chǎn)胚數(shù)為4.39個，6-9℃處理1天，產(chǎn)胚數(shù)提高到61.4個，預(yù)處理4天后，胚狀體產(chǎn)量降為10.47個[10]。,預(yù)處理方法：,2、化學物質(zhì)處理,包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等進行處理。甘露醇僅能維持滲透壓，

23、不能提供碳源，其主要原理是造成小孢子營養(yǎng)饑餓，從而使小孢子去分化。,3、其它,包括γ射線、離心、磁場等。,（五）培養(yǎng)基,1.基本培養(yǎng)基 主要為N6和MS培養(yǎng)基。在此基礎(chǔ)上發(fā)展出一些其它的培養(yǎng)基。如H培養(yǎng)基（適于煙草）、C17培養(yǎng)基（適于小麥）、馬鈴署-Ⅱ培養(yǎng)基（適于馬鈴署）,2.碳源 包括蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。不同作物所需最適的碳源種類及濃度的所差異。一般認為單子葉植物比雙子葉植

24、物需糖的濃度要高。玉米中蔗糖效果最好；而麥類作物中，麥芽糖似乎為最好的碳源。,3、激素4、氨基酸5、活性碳6、pH,（六）培養(yǎng)條件,1、溫度 物種間有差異2、光照 3、植板密度 植板密度與花培效率有很大的相關(guān)性。5×103到2×104／ml密度均能有效培養(yǎng)。一般來說，足夠數(shù)量的、但相對低密度的小孢子濃度有利于小孢子競爭營養(yǎng)、氧氣、細胞分裂的空間，從則有利于胚狀體發(fā)生。,03,02,01,

25、縮短育種周期，加快育種進程,04,克服遠緣雜交的不親和性,提高誘變育種效率,合成育種新材料，豐富遺傳資源,,,,,單倍體育種的優(yōu)點,有利變異少，須大量處理材料,,誘變的方向和性質(zhì)不能控制,,改良數(shù)量性狀效果較差,,單倍體育種的缺點,1,2,3,4,5,6,7,玉米單倍體育種技術(shù),大麥單倍體育種技術(shù),馬鈴薯雙單倍體育種技術(shù),茄子花藥培養(yǎng)技術(shù),煙草單倍體育種技術(shù),水稻單倍體育種技術(shù),甜（辣）椒花藥培養(yǎng)技術(shù),單倍體育種技術(shù)應(yīng)用,玉米單倍

26、體育種技術(shù),利用單倍體技術(shù)可縮短培育優(yōu)勢雜種時間, 克服遠緣雜交產(chǎn)生的不親合性、提高誘變育種的效率、合成玉米育種新材料。單倍體技術(shù)培育玉米自交系在美國正被玉米商業(yè)育種家廣泛地利用。在我國, 最早開展此項研究的中國科學院遺傳研究所, 通過采用孤雌生殖技術(shù), 在不到20年的時間里已育成3000多個孤雌生殖純系, 其中綜合性狀優(yōu)良或個別性狀突出, 可直接或間接用于育種的近350個,&

27、#160;選出多個優(yōu)良組合參加省級和國家級區(qū)試。遺單6號、科玉10 號、秦單5號已通過審定, 并在生產(chǎn)上進行推廣[11]。,獲得玉米單倍體技術(shù),1 自然發(fā)生的單倍體  生殖過程異常所引起的孤雌或孤雄生殖而來的玉米單倍體,自然發(fā)生的單倍體的頻率極低,僅為10-5～10- 8。由于單倍體高度不育,其植株和它的組織器官等都比它們的二倍體弱小,所以自然界中存在的單倍體很少。2

28、60;孤雌生殖  誘導玉米孤雌生殖的方法很多。利用異種花粉授粉, 刺激未受精卵發(fā)育引起孤雌生殖產(chǎn)生單倍體；利用紫外線處理的玉米成熟花粉粒給正常植株授粉, 讓已無授精能力的花粉去刺激未受精的卵細胞單性發(fā)育成單倍體的胚；利用甲苯胺藍等化學藥劑處理花粉產(chǎn)生單倍體?；瘜W藥物誘導孤雌生殖常易產(chǎn)生一些影響生理生化和形態(tài)上的畸變, 其可靠性常受到懷疑。,3 花粉、花藥培養(yǎng) 

29、 用花藥、花粉組織培養(yǎng)技術(shù)獲得單倍體。在獲得單倍體的同時，還常常出現(xiàn)已自然加倍了的二倍體和雙倍體。4 傳粉玉米子房誘導單倍體  利用花粉的生物刺激作用來誘導傳粉的玉米子房產(chǎn)生單倍體植株, 可建立起高效、穩(wěn)定的玉米單倍體誘導體系。當授粉時間控制在12～22 h, 授粉子房均有可能誘導出單倍體植株，春秋季誘導單倍體植株的效果比夏季好[12]。,5 遠緣雜交單親染

30、色體消失  在遠緣雜交中, 可能由于雙親體細胞分裂周期的不同步, 導致某一親本染色體的丟失, 從而引起單倍體的發(fā)生。6 輻射誘導  用射線照射花或父本花粉經(jīng)X射線處理后, 給去雄的母本授粉, 以影響授精, 誘導單性生殖產(chǎn)生單倍體。,7 利用高頻誘導單倍體材料  美國發(fā)現(xiàn)了一個高頻誘導單倍體

31、的材料并定名為Stock6, 為早熟、白色、粉質(zhì)、硬粒型的玉米, 后又經(jīng)過兩次回交和兩次自交導入了控制子粒性狀和植株性狀的兩種顯性標記基因。它具有兩個標記性狀: 子粒有斑紋、成株葉片和葉鞘呈紫色, 均是由互補基因控制。Stock6誘導產(chǎn)生單倍體的原理已經(jīng)清楚, 雙授精過程中一個精子與極核結(jié)合, 而另一個精子不能與卵結(jié)合形成授精卵。在育種實踐中用作父本, 被誘導的育種試

32、材作母本, 大約有3%的單倍體胚。此外還有A358、ZMS、MKS、MHI 等一些單倍體誘導材料, 均能夠產(chǎn)生大約3%的單倍體胚。,玉米單倍體育種的前景,單倍體技術(shù)在玉米育種中的應(yīng)用前景十分誘人。不僅具有理論意義，還存在著巨大的生產(chǎn)潛力。首先對目標誘導材料進行重組與改良，使其積累足夠的有利基因位點，然后利用單倍體技術(shù)使優(yōu)良的基因快速純合，獲得性狀優(yōu)良的純系，這將會極大地發(fā)揮單倍體育種技術(shù)的優(yōu)勢，極大提高玉米

33、育種的效率。未來的工作將以進一步完善單倍體誘導體系、提高單倍體誘導率和提高單倍體加倍技術(shù)為重點研究方向。另外單倍體育種技術(shù)可以和品種設(shè)計、分子育種、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等結(jié)合起來，使單倍體育種技術(shù)發(fā)揮更大作用。,單倍體育種研究的現(xiàn)狀,單倍體育種的研究，確實是取得了很好的成績。但是研究才剛剛開始，還有無數(shù)的難題依然令我們的專家束手無策。 例如：單倍體植株無法正常結(jié)實、單倍體育種在生產(chǎn)中成本高等等問題，依然無法得到很好的解決。

34、 還有，就是單倍體育種只局限與植物，而不能應(yīng)用于動物體身上。這也是有待解決的問題。,參考文獻,[1] 才卓,徐國良,劉向輝等.玉米單倍體誘導選系研究[J].玉米科學, 2004,12(1):10- 11 .[2] 陳紹江, 宋同明. 利用高油分的花粉直感效應(yīng)鑒別玉米單倍體[J].作物學報, 2003, 29(4): 587- 590 .[3] 杜娟, 母秋華, 賈玉鋒, 等. 利用橋接組合轉(zhuǎn)育的方法提高玉米花藥培

35、養(yǎng)誘導率的研究[J] . 玉米科學, 1999, 7(3): 16- 18 .[4] 韓學莉, 唐祈林, 曹墨菊, 等. 用Stock6 雜交誘導的單倍體鑒定方法初探[J] . 玉米科學, 2006, 14(1): 64- 66 .[5] 湯飛宇，王菲，王國英. 利用SSR 標記檢測來源于玉米孤雌生殖的雙倍體[ J ]. 江西農(nóng)業(yè)大學學報，2004，26（6）： 859 ～862.[6] 才卓，徐國良， CHANGMING-

36、TANG，等. 玉米單倍體育種研究進展[ J ].玉米科學，2008，16（1）：1 ～ 5.,參考文獻,[7] Blakeslee A F, et al. A haploid mutation in the jinson weed, datura stramonium[J]. Science, 1922, 55: 646- 647.[8] RandolphLF. Note on haploid frequencies[J].Mai

37、ze Genet. Coop. News Lett., 1938, 12: 12.[9] Guha S, Maheshwari S C. In vitro production of embryos fromanthers of Datura[J]. Nature, 1964, 204: 497.[10] Opatrn倀Z, Dostál J, Martinek V. AntherCultures ofMaize[J]

38、. Biologia Plantarum(praha), 1977, 19(6): 477- 480.[11] Genovesi AD, Collins GB. In vitro production of haploid plants of corn via anther culture[J]. Crop Sci., 1982, 22: 1137- 1144.[12] 劉志增, 宋同明, 騰文濤, 等. 玉米孤雌生殖誘導系的選