反硝化菌DNF409中硝酸鹽還原酶基因敲除的研究.pdf

1、養(yǎng)殖水環(huán)境的日趨惡化已成為制約我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素，而對于養(yǎng)殖業(yè)來說，亞硝酸鹽的的積累所造成的危害更甚，嚴重制約了水產(chǎn)經(jīng)濟的發(fā)展。生物反硝化法是理論上解決水體氮污染的有效方法。 本課題是以本實驗室分離到的一株臘樣芽胞桿菌DNF409為原始出發(fā)菌株，該菌株具有極強的反硝化能力，能在72h內(nèi)將硝酸鹽污染水體中的硝酸鹽，從40μg/mL的濃度降為5μg/mL以下。但在污水處理過程中存在著亞硝酸鹽嚴重積累的現(xiàn)象。課題目的是將該

2、菌株中硝酸還原酶基因，通過分子生物學手段將其敲除，成為專一降解亞硝酸鹽菌株。具體研究結(jié)果如下： (1)利用E.coli與Bacillussp.的穿梭質(zhì)粒Pdg646，構(gòu)建了基因敲除載體pDGLSR-Ts，它攜帶有兩個長度分別為1kb、920bp且與narGHIJ基因序列方向完全相同的同源臂Larm和Rarm，然后在兩段同源臂之間利用酶切插入可在菌株DNF409中表達的抗性片段Smr/Spcr，同時載體部分含有可在菌株中DNF4

3、09表達的抗性標記kanr，且?guī)в幸粋€溫度敏感型的復制子，便于重組子的篩選。 (2)將narG基因中斷載體pDGLSR-Ts電激轉(zhuǎn)化至反硝化菌DNF409中，經(jīng)過抗性篩選得到表型為smrKans。的narGHIJ部分基因敲除雙交換菌株，并通過PCR分析證實narGHIJ部分基因已經(jīng)在正確位置通過雙交換實現(xiàn)敲除。 (3)雙交換敲除菌株接入富含硝酸鹽及亞硝酸鹽的模擬污水中進行反硝化作用實驗，發(fā)現(xiàn)ZL150硝酸鹽的還原能力