06第6單元 體外分析技術

1、重慶醫(yī)科大學 李少林,第6章 體外分析技術,臨床醫(yī)學八年制核醫(yī)學教學課件,Summary,Radioimmunoassay is a highly sensitive and specific assay method (in vitro assay) that uses the competition between radiolabeled （or unradiolabeled） and unlabeled substances

2、 in an antigen-antibody reaction to determine the concentrantion of the unlabeled substances ;It can be used to determine antibody concentrantion or to determine the concentrantion.of any substance against which specific

3、 antibody can be produced.,,,待測物質濃度與檢測手段,臨床化學分析,,,,,,,pg/mL,ng/mL,mg/mL,mg/mL,g/L,免疫分析,Therapeutic Drugs,Thyroid Hormone,Fertility Hormone,Allergy,Cancer Markers,Infectious Disease,Vitamins,Serum Proteins,,,,,,,,,常量,微量,超

4、微量,,,現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展疾病診斷的革新,可在沒有任何臨床癥狀，而病人體內發(fā)生 1. 基因表達異常； 2. 受體分布異?；蚴荏w功能改變； 3. 器官代謝異常； 4. 激素水平異常 酶、神經遞質 ……等異常， 可早期發(fā)現(xiàn)。 體外分析和影像學的發(fā)展起了很大作用 例如 癌癥的早期診斷,放射免疫分析法的創(chuàng)立集中了放射性核素示蹤技術的高靈敏度和免疫發(fā)應的高特異性,1959

5、 美國Yalow & Berson1960 英國 Ekim’s1977 獲諾貝爾醫(yī)學生物學獎,開創(chuàng)了醫(yī)學生物學超微量分析方法使人體內微量生物活性物質的測量成為可能對現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展起到推動作用,R：放射性核素標記抗原高靈敏（10 -9~ -15 g/ml）探測待測物上的標記信號 (標記物的放大效應),,I：免疫學反應高特異以抗體為結合劑B:標記抗原與非標記抗原競爭與同種

6、抗體結合,定 義,以放射核素標記（或其他非放射性標記）的配體(Ligand)為示蹤劑，以配體和結合體的結合反應為基礎，在試管內進行的微量生物活性物質的檢測技術。,體外分析技術是結合了放射性核素的高靈敏度和特異性結合反應的高特異性的一種超微量分析技術，具有靈敏度高、特異性強、精密度好、應用面廣、方法簡便等優(yōu)點。,方法學基礎,結合反應遵守可逆反應的質量作用定律： k1, v1[R]+

7、[L] [RL] k2, v2,,,定量手段,放射性測量技術酶定量技術化學發(fā)光定量技術,生物學基礎,特異性結合反應： 抗原-抗體的免疫結合反應； 配基-受體的結合反應； 底物-催化酶之間的酶促反應；結合體： 抗原--抗體 激素--激素結合球蛋白 受

8、體--配體,體外分析技術,體外放射分析,體外非放射分析,放射性競爭結合分析,放射性非競爭結合分析,放射免疫分析 (RIA),免疫放射分析,酶免疫分析,化學發(fā)光免疫分析,熒光免疫分析,,,(IRMA),(EIA),(CLIA),(FIA),,,,放射免疫分析法(radioimmunoassay),Dr. Yalow,在體外條件下, 利用Ag與定量的*Ag對限量的特異性Ab的競爭結合反應，通過測定放射性復合物的量來計算出A

9、g 量的一種超微量分析技術。,基本原理,Ag-Ab + Ag,*Ag,Ab,Ag,,,,,+,+,*Ag-Ab + *Ag,(B),(F),*Ag與Ag 免疫活性相同*Ag＋Ag > Ab,,,,Ag= * Ag , AgAb=*AgAb,Ag > *Ag , *AgAb (B) *Ag(F),Ag < *Ag , *AgAb (B) *Ag (F),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

10、,,,Ag,25,50,100,200,400,800,,,,,,,*Ag,,,,,,,Ab,,分離B、F,B%=B/(B+F),F%=F/(B+F),R=B/F,,,,,,,B1%,B2%,B3%,B4%,B5%,B6%,1,2,3,4,5,6,濃度,B%,,標 準 曲 線,Ag,25,50,100,200,400,800,,,,,,,*Ag,,,,,,,Ab,,分離B、F,,,,,,,B1%,B2%,B3%,B4%,B5%,B6%,

11、1,2,3,4,5,6,,,,,,,B%,？,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,60,1．最大結合管（Bo） 標準抗原的量為0，只有標記抗原和特異性抗體時，標記抗原與抗體充分反應后分離B和F，所測得的B的放射性為Bo。這是沒有標準抗原與之競爭時，標記抗原和抗體的結合達最大值。2．非特異結合管（NSB） 標記抗原除了要和特異性抗體結合以外，還要和一些雜質蛋白或容器的管壁等結合，對我們的分析結果產生影響。NSB管是用蒸餾水代替特

12、異性抗體，在相同條件下反應后測得的放射性。,在實際的操作中，我們一般要設立以下幾個反應管：,3．總放射性管（T） 反應后不分離就直接測得的放射性就是總放射性。表示標記抗原抗體復合物和游離的標記抗原的總放射性。4．標準管（B1~Bn） 放有不同濃度的標準抗原，再加入相同量的標記抗原和特異抗體。一般在反應后分離出沉淀，測定沉淀的放射性作為B。5．樣品管（Bx） 用同劑量的樣品代替標準管中的標準抗原，在相同條件下反應和分離，同樣取沉淀

13、測得其放射性，就可以在繪制的標準曲線上找到樣品的濃度。,常用的有B%，B/F，B/Bo，F(xiàn)/B，Bo/B等這些反應變量都可以用作縱坐標來對應標準抗原的濃度作標準曲線，選用的反應變量不同，標準曲線的形狀也不同。但是這些標準曲線都是反映的反應變量對應標準抗原濃度變化而變化的函數(shù)關系。,標準曲線左：橫座標為等份刻度；　右：橫座標為對數(shù)刻度,操作基本步驟,加樣：加樣總體積要保持一致，所處的介質環(huán)境也要一致。孵育：根據(jù)不同的分析對象孵育的溫度

14、和時間不同，一般是37℃。分離：選擇好的分離方法分離游離抗原和抗原－抗體復合物。測量：測量游離或結合物部分的放射性。數(shù)據(jù)處理：繪制標準曲線和待測物濃度的計算。,基本方法,基本試劑,1.抗體,2.標記抗原,3.非標記標準抗原（標準品）,,,2.標記抗原,1）比活度和放化純度足夠高,比活度——每微克抗原上標記放射性核素的千貝可數(shù)（KBq/μg）,放化純度——具有免疫活性的標記抗原占總放射性的百分數(shù)。 >90%,2）半衰期足夠長,

15、3）保持原有抗原的特性,大分子：125I小分子：3H or 125I,3.非標記抗原 （標準品）,化學結構、免疫活性與被測抗原相同,高純度,,B和F的分離,1.第一類,2.第二類,雙抗體沉淀法,PEG沉淀法,固相第二抗體法,,,,,,,+,,,Ag,Ab(1),Ab(2),,,,,Ab(2),Ab(1),Ag,,,,,,可溶性復合物,可沉淀復合物,試管,試管,分離方法的要求,分離完全、快速。不影響免疫反應的平衡，即是要求在分

16、離過程中不使抗原-抗體復合物解離或形成新的復合物。受環(huán)境因素（溫度、pH值等）的影響小。操作簡便，分離劑來源豐富、價廉。,質量控制（quality control）,1.精密度（precision） 變異系數(shù)（ CV ）7%~10%,2.準確度（accuracy） 回收率=測定值/真實值×100% 90%~110%,3.靈敏度 （sensitivity） 方法的最小可測量,4.特異性（specif

17、icity） 交叉反應率,,5.可靠性（validity） 平行性試驗,6.穩(wěn)定性（stability）B0%，NSB，ED25，ED50，ED75,,,A,B,C,,質量控制就是使用合適的方法以檢查、表示和消除來自試劑藥盒和測量體系的誤差，并使這種誤差降低到某一允許水平。 具體作用有：1．檢查誤差的程度，決定測定結果的取舍。2．識別誤差的來源并消除其原因。3．改進測定方法的設計以提高質量。,RIA小

18、結,靈敏度高特異性好精確的定量方法操作簡便,免疫放射分析法,*Ab,+,Ag-*Ab + *Ab,,,（immunoradiometric assay,IRMA）,B%,,,,,Ag,（B）,（F）,在體外, 利用Ag與過量的*Ab的非競爭性結合反應，通過測定放射性復合物的量來計算出Ag 量。標記抗體，抗體是過量的。,IRMA與RIA工作原理的主要區(qū)別,B%,,,,B%,,,,,,,擬合的標準曲線,擬合的NSB,擬合的標準曲線

19、,擬合的NSB,IRMA的標準曲線及非特異結合曲線,RIA的標準曲線及非特異結合曲線,IRMA和RIA低劑量區(qū)的不確定因素示意圖,非放射性標記免疫分析技術,酶標記免疫分析技術化學發(fā)光免疫分析技術時間分辨熒光免疫分析技術,酶標記免疫分析技術 用酶分子代替放射性核素標記抗原或抗體，進行競爭性或非競爭性免疫分析的技術。其中應用最多的就是酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）。 是結合了抗原抗體高特異性和酶促反應的高敏感

20、性的檢測技術。,ELISA方法是用酶分子標記抗體，進行與IRMA相似的夾心法免疫反應，反應結束后分離結合部分和游離部分，利用結合部分上的酶分子的催化活性將底物轉化為特定的顏色，用分光光度計測定，顏色的深淺和酶量成正比，而酶量又和復合物的量成正比。 常用的酶是辣根過氧化物酶，底物是四甲基聯(lián)苯胺 (TMB) ，反應后顯黃色。,化學發(fā)光免疫分析技術化學發(fā)光免疫分析技術是以化學發(fā)光物質代替放射性核素作為示蹤物的超微量分析

21、技術。 化學發(fā)光物質在氧化劑或催化劑的作用下能形成激發(fā)態(tài)產物，并在退激時將能量轉化為光子的物質。,1.化學發(fā)光免疫分析 是用化學發(fā)光物質作為標記物，標記抗原或抗體，反應以后，利用堿性條件下化學發(fā)光物質在氧化物作用下可以發(fā)生單光子放射。檢測光子的數(shù)量就可以反映復合物的量。 常用的化學發(fā)光物質是異魯米那和吖啶酯。,2.化學發(fā)光酶免疫分析 和ELISA相似，用堿性磷酸酶標記抗體，經夾心法

22、免疫反應后，帶有酶的復合物作用于特殊的底物--金剛烷，使底物發(fā)射出光子。 此法光子發(fā)射持續(xù)時間較長，可靠性比較好。,3.電化學發(fā)光免疫分析(略) 4.生物發(fā)光免疫分析(略),時間分辨熒光免疫分析技術（time-resolved fluoroimmunoassay）,時間分辨熒光免疫分析采用稀土元素標記抗體，利用時間分辨熒光儀特定的延遲時間測量，獲得稀土元素的特異熒光信號，同時消除非特異性熒光物質的干擾。,標記物為具有獨特

23、熒光特性的稀土金屬—鑭系元素,鑭系元素共有15種，應用在時間分辨熒光免疫技術種有四種 釤（Sm），銪（Eu），鏑（Dy），鋱（Te）鑭系元素熒光重要特點： 1.極長的熒光衰退時間 銪：730000ns，釤：50000ns，一般熒光物質：10ns 2.200nm的Stokes位移 銪：激發(fā)光340nm，發(fā)射光613nm 熒光素的Stokes位移為273

24、nm 3.狹窄的發(fā)射峰 4.解離-增強技術可使其熒光性提高100萬倍,時間分辨熒光免疫分析技術（time-resolved fluoroimmunoassay）,基本原理,鑭系元素（15）：銪（Eu），釤（Sm），鏑（Dy），鋱（Te）,,,Eu,,+,,,,,,,Eu,,,,Eu,+,,增強液,,,,,+,“解離增強鑭系熒光免疫分析”,,時間分辨熒光檢測的基本原理示意圖,熒光衰退時間銪：730000 ns釤：5

25、0000 ns一般熒光物質：10 ns,銪的熒光,TrFIA的特點,1.最大限度提高測量方法的靈敏度2.有與RIA相似的特異性和精密度3.可同時測定兩種以上的抗原4.無輻射污染,DELFIA技術的特點為臨床檢測帶來的先進性,總結 體外分析的發(fā)展,方法設計的改變：競爭結合分析 非競爭結合分析，代表方法是免疫放射分析標記物的改變：放射性核素 熒光、酶、化學發(fā)光、稀土元素結合體

26、的改變,,,微生物 ——RMA 酶 ——REA 受體 ——RRA 特異結合蛋白 ——CPBA 改變結合體對放射性技術 Ag Ag-Ab RIA + Ab免疫學技術

27、 ※Ag ※Ag-Ab 改變標記物第一階段 第二階段 第三階段,,,,,,,,,,,小分子半抗原聯(lián)接125I單克隆技術固相技術藥品化Kit,理論與實踐上更豐富更完善的RI