pcr實(shí)用技巧大全

1、PCRPCR實(shí)用技巧實(shí)用技巧20055139:37:19來源：互聯(lián)網(wǎng)增加PCR的特異性：1.primersdesign這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些條件a.足夠長1824bp以保證特異性.當(dāng)然不是說越長越好太長的引物同樣會(huì)降低特異性并且降低產(chǎn)量b.GC%40%~~~~60%c.5端和中間序列要多GC以增加穩(wěn)定性d.避免3端GCrich最后3個(gè)BASE不要有GC或者最后5個(gè)有3個(gè)

2、不要是GCe.避免3端的互補(bǔ)否則容易造成DIMERf.避免3端的錯(cuò)配g.避免內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)h.附加序列(RTsitePromotersequence)加到5端在算Tm值時(shí)不算但在檢測互補(bǔ)和二級結(jié)構(gòu)是要加上它們i.使用兼并引物時(shí)要參考密碼子使用表注意生物的偏好性不要在3端使用兼并引物并使用較高的引物濃度(1uM3uM)j.最好學(xué)會(huì)使用一種designsoftware.PP5Oligo6DNAstarVectNTIOnlinedesgin

3、etal.引物的另一個(gè)重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當(dāng)50％的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時(shí)的溫度.Tm對于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm低5℃。設(shè)定Tm有幾種公式。有的是來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。有的是根據(jù)GC含量估算Tm。確定引物Tm最可信的方法是近

4、鄰分析法。這種方法從序列一級結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計(jì)算機(jī)程序使用近鄰分析法。根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同，Tm會(huì)差異很大。因?yàn)榇蟛糠止教峁┮粋€(gè)估算的Tm值，所有退火溫度只是一個(gè)起始點(diǎn)?？梢酝ㄟ^分析幾個(gè)逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會(huì)減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得最佳結(jié)果，兩個(gè)引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果

5、超過5℃，就會(huì)引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯(cuò)誤起始。如果兩個(gè)引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的Tm低5℃或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計(jì)的退火溫度先進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm重點(diǎn)到了：一般情況下是從55度開始.根據(jù)情況配合以Mg離子濃度進(jìn)行調(diào)整.有條件的可以做gradientpcr.退火的時(shí)間在3060S時(shí)間短一些可以得到更好的效果.因?yàn)閜olymerase在annealingtemp.時(shí)也會(huì)有一些活

6、性.所以在A.T.的時(shí)間過長會(huì)極大的增加非特異性擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn)，另外在對于一些困難戶比如從gDNA里擴(kuò)增大片段還可使用twostepPCR.5.touchdownPCR原理很簡單但的確是一個(gè)很有用的方法。舉個(gè)例子，ANNEALINGTEMP.55度945min9430s6030s721min2cycles9430s5930s721min2cycles9430s5830s721min2cycles9430s5130s721min2cycles

7、9430s5030s721min20cycles725min6.hotstartPCR熱啟動(dòng)PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。盡管TaqDNA聚合酶的最佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進(jìn)行PCR反應(yīng)配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時(shí)會(huì)產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會(huì)被有效擴(kuò)增。在用于引物設(shè)計(jì)的位點(diǎn)因?yàn)檫z傳元件的定位而受限時(shí)，如sitedirected

8、突變、表達(dá)克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動(dòng)PCR尤為有效。限制TaqDNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。熱啟動(dòng)通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達(dá)到變性溫度。包括延緩加入TaqDNA聚合酶，在反應(yīng)體系達(dá)到90度時(shí)，PAUSE，將溫度保持在70度以上，手工加入polymerase，但這

9、個(gè)方法過于煩瑣，尤其是對高通量應(yīng)用，并容易造成污染。其他的熱啟動(dòng)方法使用蠟防護(hù)層將一種基本成分，入鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應(yīng)成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時(shí)，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。有很多公司提供這樣的酶。=======================ampliwaxPCRGems(PerkinElmer)TaqBeadHotStartPolymerase(Promega)Magnesiumwaxb

10、eads(Stratagene).=========================象手動(dòng)熱啟動(dòng)方法一樣，蠟防護(hù)層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應(yīng)用。還有一種方法是使用inactiveDNAPolymerase.polymerase被抗體抑制失活，當(dāng)變性溫度超過70度時(shí)，抗體也變性了，這樣polymerase又被激活了。7.BoosterPCR我們知道1ughumangenomicDNA大約在3X105冪個(gè)模板分子這樣的模板分子