血細(xì)胞分析儀檢測技術(shù)及臨床應(yīng)用課件_1

1、血細(xì)胞分析儀檢測技術(shù)及臨床應(yīng)用,血細(xì)胞分析儀檢測是臨床診斷工作中最常用的實(shí)驗(yàn)方法之一40年代后期美國庫爾特先生(W.H.Coulter)發(fā)明了粒子計(jì)數(shù)技術(shù)(電阻抗法),50年代初期應(yīng)用于血細(xì)胞計(jì)數(shù),血細(xì)胞分析儀檢測原理,一.電阻抗法(庫爾特原理)1.血細(xì)胞具有非傳導(dǎo)性質(zhì)(不良導(dǎo)體)2.E=I x R→脈沖信號(hào)3.脈沖信號(hào)大小與細(xì)胞體積成正比4.脈沖信號(hào)的多少代表細(xì)胞數(shù)量,細(xì)胞的三分群：各種細(xì)胞在溶血?jiǎng)┲?，?jīng)溶血?jiǎng)┲斜砻婊钚?/p>

2、劑對(duì)細(xì)胞膜表面的脂蛋白作用后而分群，由于RBC膜表面的脂蛋白含量最少而易被破壞溶解,白細(xì)胞的細(xì)胞漿漏出，僅留下核與顆粒并使細(xì)胞縮小，原來最大的單核細(xì)胞經(jīng)溶血?jiǎng)┳饔煤?，體積就落在了小的淋巴和大的中性粒細(xì)胞之間，這樣就按照溶血?jiǎng)┳饔煤篌w積大小，將白細(xì)胞分成三群。,淋巴細(xì)胞：35-90fl; 中間細(xì)胞：90-160fl; 粒細(xì)胞>160fl依照三群細(xì)胞在白細(xì)胞體積分布的直方圖上所分布區(qū)域的面積，計(jì)算得出每群細(xì)胞的百分比，并依照白細(xì)胞計(jì)

3、數(shù)總數(shù)，求得每群細(xì)胞的絕對(duì)值。注意:各廠家的溶血?jiǎng)┡浞讲煌耆嗤?對(duì)白細(xì)胞膜的作用程度不同,而各廠家對(duì)儀器的各類WBC區(qū)分設(shè)置也不盡相同.,RBC及相關(guān)參數(shù)的檢測RBC檢測→電阻抗原理脈沖信號(hào)高度的疊加→HCT單個(gè)脈沖信號(hào)高度的均值→MCVRBC:36—360fL區(qū)間分析RDW:儀器將不同大小的脈沖信號(hào)分別貯存在不同通道,計(jì)算出相應(yīng)的體積和數(shù)目,再統(tǒng)計(jì)處理得到RDW,用RBC體積的CV或SD表示.RBC計(jì)數(shù)中WBC含量可忽

4、略不計(jì),但在白血病或WBC異常增高時(shí)則對(duì)RBC及其相關(guān)參數(shù)有明顯影響.,PLT檢測:電阻抗原理PLT和RBC一起同時(shí)被檢測PLT體積分布:2—28fL,不同儀器的PLT直方圖 范圍不一.MPV:是PLT體積分布直方圖的產(chǎn)物MPV與PLT成非線性負(fù)相關(guān)PCT參考范圍是一不恒定參數(shù)PDW:是PLT體積分布直方圖的產(chǎn)物PLCR:＞12fL的PLT比率,浮動(dòng)界標(biāo)技術(shù) 1.RBC/PLT :

5、 為便于識(shí)別，在RBC/PLT通道一般把體積大于30f1的細(xì)胞計(jì)為紅細(xì)胞(RBC)，而把體積小于30f1的細(xì)胞計(jì)為血小板(PLT)。一般的血細(xì)胞分析儀，PLT和RBC的分界點(diǎn)是固定的(例如30f1處)，這種情況屬于固定界標(biāo)。但也有例外的情況，有些公司的血細(xì)胞分析儀，可以把PLT和RBC的分界點(diǎn)人為地設(shè)置在5-30f1的范圍內(nèi)，在實(shí)測樣本時(shí)，儀器根據(jù)PLT和RBC的分布曲線，自動(dòng)在所設(shè)定的范圍內(nèi)尋找最低點(diǎn)，以得到正確的PLT. RBC及相

6、關(guān)參數(shù)的結(jié)果，這就是浮動(dòng)界標(biāo).,2.WBC : 當(dāng)直方圖出來后，由軟件程序自動(dòng)判別并尋找直方圖上三個(gè)區(qū)域的起止點(diǎn)（即第一個(gè)高峰起止和第二個(gè)高峰地點(diǎn)）作為界標(biāo)線，并以此為依據(jù)進(jìn)行判讀，由于設(shè)計(jì)理念的不同，稀釋液和溶血?jiǎng)?duì)細(xì)胞的作用不同于固定界標(biāo)，因此，浮動(dòng)界標(biāo)的wbc直方圖很少有能超過350fl的橫坐標(biāo)。直方圖每次的結(jié)果是不一樣的，因此界標(biāo)線的位置也是不一樣，這就形成界標(biāo)線的移動(dòng)，就是浮動(dòng)界標(biāo),Hb檢測:

7、與WBC一起被檢測SLS-HGB檢測血紅蛋白：測定原理：亞鐵血紅素中的Fe2+離子被十二烷基磺酸鈉氧化，形成SLS-HGB衍生物，在550nm波長進(jìn)行比色測定。SLS-Hb法測定與ICSH的參考方法相比，具有非常高的相關(guān)性(r=0.999)。,二.血細(xì)胞檢測技術(shù)的發(fā)展（五分類）1。光散射法(Scatter): 來自激光光源的單色光束在10°--70°對(duì)細(xì)胞進(jìn)行掃描,提供細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)的光散

8、射信息。 光散射特別具有對(duì)細(xì)胞顆粒的構(gòu)型和顆粒質(zhì)量的區(qū)別能力，從而將三種粒細(xì)胞區(qū)分。 利用高低角度光散射可同時(shí)對(duì)PLT和RBC進(jìn)行計(jì)數(shù).高角(5-15°)測量RBC數(shù),檢測PLT內(nèi)容物.低角(1-3°)檢測RBC\PLT體積.,2。電導(dǎo)法 根據(jù)細(xì)胞壁能產(chǎn)生高頻電流的性質(zhì)采用高頻電磁探針，測量細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)、核漿比、細(xì)胞內(nèi)顆粒大小和密度。 電導(dǎo)法可辨別體積相同而性質(zhì)不同的

9、兩個(gè)細(xì)胞群（如；小淋巴和嗜堿）,3。射頻技術(shù)； 在測量小孔的內(nèi)外電極裝有直流和高頻兩個(gè)發(fā)射器，因此在小孔周圍產(chǎn)生直流和射頻兩種電流，直流電僅能測量細(xì)胞大小，而射頻可透入細(xì)胞內(nèi)，測量核的大小及顆粒的多少。 利用阻抗+射頻技術(shù)可將淋巴、單核、粒細(xì)胞區(qū)分。,4.過氧化物酶染色技術(shù)過氧化氫酶含量:嗜酸粒細(xì)胞＞中性粒細(xì)胞＞單核細(xì)胞. 淋巴和嗜堿粒細(xì)胞無由于酶反應(yīng)陽性程度不同,通過激光束時(shí)的吸光度也就不同,加上光散射及

10、特殊溶血?jiǎng)┑淖饔每蛇M(jìn)行五分類.,5.核酸熒光染色技術(shù)利用聚次甲基熒光染色液對(duì)有核細(xì)胞的核酸(DNA/RNA)進(jìn)行熒光染色。采用半導(dǎo)體激光流式細(xì)胞檢測，獲得WBC/DIFF散點(diǎn)圖并得到新的檢測參數(shù)IG和OTHER。通過對(duì)散點(diǎn)圖的分析，可獲得LYMPH、MONO、EOS、NEUT+BASO及NRBC和Ret的測定結(jié)果。最早的全自動(dòng)網(wǎng)織紅分析儀R-1000TM，用熒光染料堿性槐黃；最新采用的是聚次甲基染料，用來進(jìn)行WBC四分類、網(wǎng)織紅細(xì)胞測

11、定、有核紅細(xì)胞測定，該染料被紅色半導(dǎo)體激光（波長為633nm）激發(fā)后發(fā)出660nm或更高波長的紅色熒光。,該技術(shù)采用檢測三種光學(xué)信號(hào)(前向散射光、側(cè)向散射光、側(cè)向熒光)進(jìn)行白細(xì)胞分類的測定。前向散射光：細(xì)胞大小信息。所采集的前向散射光信號(hào)用于對(duì)WBC/BASO的測定。側(cè)向散射光：反映細(xì)胞核及顆粒的信息(主要是顆粒的復(fù)雜性) 。所采集的側(cè)向散射光信號(hào)用于WBC/BASO和WBC/DIFF的測定。側(cè)向熒光：通過對(duì)核酸(DNA和RNA)

12、進(jìn)行染色，熒光信號(hào)提示細(xì)胞核酸的信息。所采集的側(cè)向熒光信號(hào)用于WBC/DIFF 的測定。,,,,,,,三.血細(xì)胞分析檢測項(xiàng)目的進(jìn)展1.幼稚細(xì)胞的檢測:⑴幼稚白細(xì)胞膜上的脂質(zhì)較成熟白細(xì)胞為少，使用含有能固化細(xì)胞膜和胞漿的硫化氨基酸的溶血?jiǎng)?，由于脂質(zhì)的成分、含量及在細(xì)胞膜上的占位不同，結(jié)合在幼稚白細(xì)胞上的硫化氨基酸較成熟白細(xì)胞為多，使胞膜和漿都固化，對(duì)溶血?jiǎng)┲芯哂腥苎饔玫姆请x子表面活性劑具有抵抗作用，加入溶血?jiǎng)┖?，成熟白?xì)胞被溶解，而

13、幼稚白細(xì)胞得以保存 ,通過DC檢測出幼稚細(xì)胞,⑵核酸熒光染色:根據(jù)細(xì)胞成熟度的不同可以體現(xiàn)在其熒光信號(hào)的強(qiáng)弱上，其白細(xì)胞分類通道除正常細(xì)胞分類外，還有兩個(gè)幼稚白細(xì)胞的定量參數(shù)： IG （幼稚粒細(xì)胞）和 Other （原始細(xì)胞 / 異常淋巴） ,激光照射后產(chǎn)生熒光信號(hào)，和側(cè)向散射光一道繪制成二維散點(diǎn)圖進(jìn)行白細(xì)胞分類。,,利用幼稚細(xì)胞(IMI)的檢測可應(yīng)用于外周血干細(xì)胞移植(PBSCT).PBSCT技術(shù)的關(guān)鍵是確定移植所需PBSC的量和采

14、集PBSC的最佳時(shí)機(jī).在外周血幼稚或原始細(xì)胞增加的同時(shí),伴隨著干細(xì)胞的增加,因此IMI+細(xì)胞可間接反映PBSC骨髓多能干細(xì)胞無法檢測,而?！奘杉?xì)胞集落形成單位系造血干細(xì)胞分化而來是造血祖細(xì)胞(HPC)的一種基于骨髓和外周HPC表達(dá)同樣的CD34+因此可用流式分析HPC, 含CD34+細(xì)胞不是單一細(xì)胞而是包括原始到不成熟粒細(xì)胞的連續(xù)分布群。因此在血細(xì)胞分析儀上利用幼稚細(xì)胞的檢測可間接反映HPC,2.有核紅細(xì)胞的測定將

15、血液和測定有核紅細(xì)胞的試劑相混合，正常紅細(xì)胞中的血紅蛋白滲出，只剩下光學(xué)透明的細(xì)胞膜或碎片。有核紅細(xì)胞和白細(xì)胞被試劑中的聚次甲基染料快速滲入。但有核紅細(xì)胞的核很難和染料結(jié)合，因?yàn)樗暮巳旧|(zhì)發(fā)生固縮，不易著色。著色后的細(xì)胞排成流式細(xì)胞，并被633nm的紅色激光束照射，測得細(xì)胞所產(chǎn)生的前向散射光強(qiáng)度和側(cè)熒光強(qiáng)度。二維散射圖的橫坐標(biāo)表示側(cè)熒光強(qiáng)度、縱坐標(biāo)表示前向散射光強(qiáng)度。,以前檢測有核紅細(xì)胞的分析系統(tǒng)中，用酸性低滲性鹽溶液作為溶血素，用

16、PI（propidium iodide）或EB溴化乙啶 （ethidium bromide）染有核紅細(xì)胞的核，，但是該方法不能從損傷（死亡）的淋巴細(xì)胞中區(qū)分有核紅細(xì)胞,3.網(wǎng)織紅細(xì)胞檢測(血細(xì)胞分析儀器)1.用新亞甲藍(lán)(A 液) 染紅細(xì)胞內(nèi)RNA;再用含透明劑的硫酸(B 液) 使紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白溢出,成為影細(xì)胞,處理后的血液在儀器上應(yīng)用VCS原理進(jìn)行檢測(Coulter)2.將抗凝全血加入網(wǎng)織紅細(xì)胞試劑(氧氮雜芑750)中，孵育1

17、5~45 min上機(jī)測定，數(shù)據(jù)分析由儀器中網(wǎng)織紅細(xì)胞分析程序完成，無需人工干預(yù)。(Technicon H*3) 此兩種方法均為人工機(jī)外染色,3. Sysmex 早期采用堿性槐黃作染料,用于網(wǎng)織紅計(jì)數(shù)儀(R系列). 后采用激光流式原理和細(xì)胞核酸染色。除了進(jìn)行自動(dòng)的 RET 數(shù)目和百分比計(jì)數(shù)外，還可以通過核酸染色得到的熒光信號(hào)強(qiáng)度區(qū)分低、中、高熒光強(qiáng)度的網(wǎng)織紅（ LFR 、 MFR 、 HFR ）。由于幼稚的網(wǎng)織紅熒光信號(hào)較強(qiáng)， MFR

18、 和 HFR 之和即反映未成熟網(wǎng)織紅的一個(gè)有用參數(shù)RMI .(XE-2100 、 XT-2000i )。,4.運(yùn)用免疫表型法配合VCS檢測技術(shù)分析CD4、CD8白細(xì)胞亞群先以抗CD4及CD8的抗體包被乳膠球標(biāo)記CD4、CD8陽性細(xì)胞，被標(biāo)記的細(xì)胞在激光散射的特性方面與其它細(xì)胞明顯不同，上機(jī)后可被儀器識(shí)別并計(jì)數(shù)?？稍?分鐘內(nèi)快速得到CD4、CD8細(xì)胞的絕對(duì)值、百分比、和CD4／CD8比值,5.網(wǎng)織血小板檢測 網(wǎng)織血小

19、板（Reticulated Platelets, RP）是從骨髓釋放入血的新生血小板，與成熟血小板相比 ，體積大，蛋白質(zhì)合成能力強(qiáng)，RNA含量多。1 網(wǎng)織血小板的得名:1969年國外學(xué)者應(yīng)用新亞甲藍(lán)染料,對(duì)犬外周血進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)血小板內(nèi)有一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物，故將這一部分血小板命名為網(wǎng)織血小板 2 網(wǎng)織血小板檢測方法 :熒光色素-噻唑橙（thiazole orange,TO）。奧黃O（Auramine O,AO）,四.保證計(jì)數(shù)精密

20、度\準(zhǔn)確性的技術(shù)1容量限定:⑴稀釋液容量控制 ⑵浮球定量2控制細(xì)胞通過小孔時(shí)及計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性的技術(shù) ⑴重疊校正 ⑵脈沖編輯 ⑶高精度體積分析 ⑷掃流技術(shù) ⑸鞘流技術(shù) ⑹浮動(dòng)界

21、標(biāo)技術(shù) ⑺延時(shí) 計(jì)數(shù) ⑻電子擬合曲線,在目前國內(nèi)眾多的五分類血液分析儀當(dāng)中，主要品牌有：光電、ABX、東亞，庫爾特、雅培、拜爾,COULTER MAXM五分類血細(xì)分析儀集庫爾特原理及VCS技術(shù)于一身，提供完整的白細(xì)胞五項(xiàng)分類和全血細(xì)胞計(jì)數(shù) 運(yùn)用流體動(dòng)力（鞘流）令細(xì)胞成單一排列，逐個(gè)通過檢測位置，每個(gè)細(xì)胞同時(shí)接受VCS三項(xiàng)技術(shù)的測量，VCS測量技術(shù)包括細(xì)胞

22、體積(V),細(xì)胞傳導(dǎo)性 (C)及細(xì)胞激光散射性（S）。以活性染料新亞甲藍(lán)（NMB）對(duì)網(wǎng)織紅細(xì)胞進(jìn)行染色，漂清本底后，運(yùn)用激光散射技術(shù)從成熟的紅、白細(xì)胞和血小板中辨別出網(wǎng)織紅細(xì)胞并計(jì)數(shù)。,XE-2100   XE-2100采用了先進(jìn)的半導(dǎo)體流式細(xì)胞分析系統(tǒng)結(jié)合核酸熒光染色技術(shù)，是目前世界上速度最快的血液分析儀器（150個(gè)標(biāo)本/小時(shí)）；同時(shí)還可以為臨床提供更多的定量的檢測參數(shù)，包括有核紅細(xì)胞（NRBC）、造血祖細(xì)胞（HPC）、未