冷凍電鏡三維重構(gòu)

1、冷凍電鏡三維重構(gòu)2004.6冷凍電鏡三維重構(gòu)北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物物理系北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物物理系王佩榮王佩榮摘要：冷凍電子顯微學(xué)從創(chuàng)立到現(xiàn)在已發(fā)展成為確定蛋白質(zhì)分子，蛋白質(zhì)復(fù)合物和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的一種有效、的方法這表現(xiàn)在三位冷凍電鏡技術(shù)的不同方面。這主要包括適合于顯微鏡真空環(huán)境的樣品制備條件，減少輻射損傷的策略，提高未經(jīng)染色的電子顯微像的信躁比的方法和二位投影三位重構(gòu)的不同方法。冷凍電鏡通過(guò)高壓快速液氮冷凍的制樣方法能夠使樣品處在接近于生理環(huán)境

2、的玻璃態(tài)冰中從而保持其天然構(gòu)像，并且由于快速冷凍可以捕捉到某個(gè)反應(yīng)過(guò)程的中間狀態(tài)從而可以對(duì)大分子復(fù)合物進(jìn)行生物學(xué)功能的動(dòng)態(tài)研究。確定三維結(jié)構(gòu)的方法主要有電子晶體學(xué)方法、單粒子重構(gòu)法和電子斷層成像技術(shù)。在主要的測(cè)定結(jié)構(gòu)的方法種，冷凍電鏡是唯一的能研究小到小的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)復(fù)合物大到細(xì)胞器甚至整個(gè)細(xì)胞的方法。關(guān)鍵詞：冷凍電鏡；三維重構(gòu)；單粒子法；斷層成像；電子晶體學(xué)引言引言在大量的基因序列被闡明后人們發(fā)現(xiàn)這還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能解釋復(fù)雜的生命活動(dòng)，必須

3、對(duì)功能活動(dòng)的執(zhí)行者基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能上的研究才能更好的理解生命過(guò)程。而以蛋白質(zhì)為主體的生物大分子的功能主要決定于它們的三維結(jié)構(gòu)。因此以Ｘ射線晶體學(xué)、核磁共振技術(shù)(ＮＭＲ)、電子顯微學(xué)和計(jì)算生物學(xué)為基本研究手段的結(jié)構(gòu)生物學(xué)將在其中扮演越來(lái)越重要的角色。Ｘ射線晶體學(xué)是目前分辨率最高的結(jié)構(gòu)測(cè)定方法，已經(jīng)非常成功地解析了大量單個(gè)分子的三維結(jié)構(gòu)。但是這種方法有一定的局限性：由于大分子復(fù)合物不易于形成三維晶體，很多疏水性蛋白也不易于

4、形成晶體，或者只有在去除一些柔性區(qū)域后才能形成好的三維晶體，這限制了Ｘ射線晶體學(xué)的應(yīng)用范圍，另外由于晶格的約束干擾了對(duì)分子間相互作用，這并不利于對(duì)于蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行研究。NMR非常適合對(duì)水溶性的蛋白質(zhì)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)測(cè)定，雖然也發(fā)展了一些新的技術(shù)如固相核磁共振（solidNMR）等可用于對(duì)小的膜蛋白的結(jié)構(gòu)測(cè)定，但需獲得在脂雙層上高度有序排列的樣品，而且分子量仍然是NMR的一個(gè)限制因素。二十世紀(jì)七十年代TaylK和GlaeserRM開(kāi)創(chuàng)了冷凍

5、電子顯微術(shù)（cryoelectronmicroscopyCryoME）[1]，經(jīng)過(guò)近三十年的發(fā)展，冷凍電鏡技術(shù)已經(jīng)成為研究生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的強(qiáng)有力的手段。最近幾年冷凍電鏡的發(fā)展在研究大分子結(jié)構(gòu)上的分辨率已達(dá)到1015。雖然不及Ｘ射線晶體學(xué)但它具有許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：可以對(duì)均一的（如膜蛋白的二維晶體，二十面體對(duì)稱的病毒等對(duì)稱結(jié)構(gòu)）不均一的（如核糖體等）樣品用不同的方法進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)重構(gòu)，可以對(duì)生物大分子及其復(fù)合物或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定，使小到

6、蛋白質(zhì)大到真核細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)得以確定，分子量大小跨越了12個(gè)數(shù)量級(jí)。通過(guò)快速冷凍可以將樣品保存在生活狀態(tài)，其結(jié)構(gòu)更接近功能活性狀態(tài)；由于快速冷凍可以捕捉到反應(yīng)過(guò)程的瞬時(shí)狀態(tài)從而易于進(jìn)行時(shí)間分辨層面上的研究，從而對(duì)一些反應(yīng)瞬時(shí)過(guò)程，和反應(yīng)中間體進(jìn)行研究，有助于對(duì)蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)特性和功能的研究。三維冷凍電鏡技術(shù)將更完善的樣品制備方法，先進(jìn)的儀器設(shè)備，更好的成像方法和強(qiáng)有力的數(shù)據(jù)處理和運(yùn)算方法結(jié)合起來(lái)，使結(jié)構(gòu)測(cè)定的分辨率不斷得到提高。樣品制備

7、主要采用第1頁(yè)冷凍電鏡三維重構(gòu)2004.6的圖象來(lái)進(jìn)行矯正和平均以增加SNR從而獲得結(jié)構(gòu)信息。場(chǎng)發(fā)射槍的應(yīng)用提高了原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量，新的計(jì)算機(jī)軟件的應(yīng)用使遠(yuǎn)距離顯微操做和記錄成為可能。電子晶體學(xué)，單粒子法，電子斷層成像技術(shù)分別針對(duì)較小的對(duì)稱結(jié)構(gòu)，較大的不對(duì)襯結(jié)構(gòu)和更大的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行三維重構(gòu)和功能研。三種重構(gòu)方法的比較見(jiàn)圖1[3]1.冷凍電鏡單粒子法及其應(yīng)用：冷凍電鏡單粒子法及其應(yīng)用：三維冷凍電子顯微術(shù)已經(jīng)在確定結(jié)構(gòu)組成和大分子復(fù)合物的結(jié)

8、構(gòu)層次方面取得了重要進(jìn)展。單粒子冷凍電鏡技術(shù)是獲得三位重構(gòu)圖像的重要的方法。單粒子法就是對(duì)分離純化的顆粒狀分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。既可以對(duì)有二十面對(duì)稱結(jié)構(gòu)的病毒或螺旋對(duì)稱結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，也可以對(duì)象核糖體等大的可溶性復(fù)合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，還可以對(duì)溶解狀態(tài)的膜蛋白進(jìn)行分析。其基本原理是通過(guò)對(duì)相同的生物大分子某方向的投影顯微像在時(shí)空中經(jīng)調(diào)整后進(jìn)行疊加，從而提高信噪比，最后將不同投影方向的單顆粒顯微像在三維空間進(jìn)行重構(gòu)獲得單顆粒大分子的三維結(jié)構(gòu)信息。主要

9、步驟可分為以下幾點(diǎn)：1、制備化學(xué)和結(jié)構(gòu)上均一的生物大分子的冰凍含水樣品，2、選擇最有可能能夠產(chǎn)生最佳圖像的最佳的顆粒密度和玻璃態(tài)冰厚度的樣品，3、設(shè)定最佳的參數(shù)（比如：欠焦值、放大倍數(shù)和電子劑量等）記錄這些樣品區(qū)域的大量圖像，4、用手工或半自動(dòng)程序選擇那些離散的分子形成的投影圖，5、通過(guò)計(jì)算不同圖像之間的相對(duì)方位來(lái)重組出復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)模型。6、最后可以利用從晶體學(xué)或NMR獲得的結(jié)構(gòu)將原子坐標(biāo)定位到密度圖中。為了使結(jié)構(gòu)的分辨率接近10或

10、更高，也可以對(duì)在分離的和圖1電子顯微學(xué)方法中三種研究對(duì)象和三維重構(gòu)方法。Missingcone(缺失錐)是指由于樣品傾轉(zhuǎn)角度范圍的限制使得倒易空間中有一個(gè)錐形區(qū)域的信息丟失。Fig.1thediagramillustrationofthreemethodsinelectronmicroscopy.Missingconemeanstheinfmationofaconeinthereciprocalspaceismissingduetoth