耐冷菌pseudomonassp.w7所產(chǎn)低溫蛋白酶的酶譜分析及基因克隆

1、分類號???????．U D C ????????●o ?密級???????Z 囂廬夕擎碩士研究生學(xué)位論文耐冷菌P s e u d o m o n a s s p ．W 7 所產(chǎn)低溫蛋白酶的酶譜分析及基因克隆申請人：學(xué) 號：培養(yǎng)單位：學(xué)科專業(yè)：研究方向：指導(dǎo)教師：完成日期：黃曉蕾2 1 0 0 6 9 3生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)微生物分子生物學(xué)康傳紅教授2 0 1 3 年5 月2 0 日黑龍江大學(xué)碩士學(xué)位論文在1 5 。C 、2

2、 0 “ C 和2 5 。C 下分別培養(yǎng)耐冷菌P s e u d o m o n a ss p ．w 7 ，對發(fā)酵液上清進行酶譜分析發(fā)現(xiàn)，該菌株在1 5 ℃下只產(chǎn)一種低溫蛋白酶P l ，酶活力為6 2 ．6U - m L - 1 ，而在2 0 ℃和2 5 ℃下產(chǎn)兩種低溫蛋白酶P 1 和P 2 ，酶活力為1 9 3 ．2U ·m L “ 1和1 3 4 ．0U ·m L ～。我們選擇了酶活力較高的蛋白酶P 2 條帶進行

3、質(zhì)譜鑒定，質(zhì)譜結(jié)果由M A S C O T 檢索比對得知，沒有找到與低溫蛋白酶完全匹配的蛋白，匹配率最高的蛋白的分?jǐn)?shù)為8 4 ，推測該低溫蛋白酶是一種新蛋白。與低溫蛋白酶匹配度最高的蛋白為原腸胚鋅指蛋白( R e e N a m e ：F u l l = G a s t m l az i n c f i n g e r p r o t e i nX 1 C G F 2 8 ．1 ) 。該蛋白由2 5 2 個氨基酸組成，其中與目的蛋白酶有

4、1 2 個肽段匹配。利用匹配的肽段設(shè)計引物，以耐冷菌P s e u d o m o n a ss p ．W 7 基因組D N A 為模板進行P C R 擴增，獲得了長為1 7 9 8 b p 的序列，分析后發(fā)現(xiàn)其中含有1 2 3 8 b p 的5 ’端序列。同理設(shè)計引物，P C R 擴增出3 ’端長為6 7 S b p 的序列，將兩段序列拼接并通過P C R 驗證得到完整的O R F , 全長為1 7 3 7 b p 的序列。該序列編碼

5、5 7 8 個氨基酸，理論分子量為6 3 8 2 1 D a 。對以上序列在N C B I 中進行同源性比對分析發(fā)現(xiàn)，該序列與原腸胚鋅指蛋白的同源性只有4 3 ％，結(jié)合質(zhì)譜分析結(jié)果推測該低溫蛋白酶是一種新蛋白。分析該序列的氨基酸組成發(fā)現(xiàn)，序列中甘氨酸含量很高，且一些小分子量氨基酸的含量也很高。這說明此蛋白序列具有低溫酶的低溫特性。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該序列含有3 個N ．糖基化位點，但不含有信號肽序列，在二級結(jié)構(gòu)中a 螺旋占3 2