荔枝(litchichinensissonn.)基因槍轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立與優(yōu)化研究

1、福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文荔枝(Litchi chinensis Sonn.)基因槍轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立與優(yōu)化研究姓名：桑慶亮申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：果樹學(xué)指導(dǎo)教師：賴鐘雄;潘東明2002.5.1‘塑塞查墊查蘭堡主絲絲查 墨墨塑蘭E s t a b l i s h m e n t a n dO p t i m i z a t i o no f T r a n s g e n i cS y s t e m v i aP a r t i c l e

2、B o m b a r d m e n t i nL i t c h i ( L i t c h ic h i n e n s i s S o n n ．)I n t h e p r e s e n t s t u d y 、aj l i 曲e f f i c i e n t t r a n s g e n i c s y s t e m v i a p a r t i c l e b o m b a r d m e n tw a se

3、 s t a b l i s h e da n d o p 6 m i z e du s i n gt h eh i n g - t e r mm a i n t a i n e de m b q ’o g e r d cc a n ( E c ) i n d u c e df r o mi m m a t u r ee m b r y o so f L i t c h ic h i n e n s i sS o n n c v X i

4、 a f a n z h i T h em a i nr e s u l t sw a r ed e s c r i b e da sf o l l o w s ：1 ) A h i g h e f f i c i e n t p l a n t r e g e n e m l l o n s y s t e m w a se s t a b l i s h e d t h r o u g ho p l l m i z a t i o

5、n o fp a m m a t e r s a f f e c t i n gs o m a t i ce m b r y o g e n e s i si nl i t e h i T h eo p d m M m e d i u m f o ri n d u c i n gs o m a t i ce m b r y e g e n e s i sw a sM Sm e d i u m s u p p l e m e n t e

6、dw i t h5 m g ／Lz e a t i n ( Z T ) ，6 ％s u c r o s ea n dl O ％a g a r S o m a t i ce m b r y o sm a t u r e d 0 1 2M S m e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t h6 ％s u c r o s e l O ％a g a ra n d1 0 ％c o c o n u t w a t

7、e r ，c w ) a n d g e r r r 6 n a t e d o nM S m e d i u m w i t h o u tp l a n tg r o m h r e g u l a t o r sb u ts u p p l e m e n t e d w i t h 2 ％s u c r o s ea n d 07 ％a g a r2 ) A n a p p r o p r i a t er e c i p i

8、e n ts y s t e mf o rl i t c h i g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o nw a se s t a b l i s h e d C a l l ip r e —c u l t u r e d f o r 4 - 5d a y s w e r e p r o v e d a t t h e i r r a p i d - g r o w t h s t a g e t

9、 h i o u g h t h e m e a s u r e m e n to f E Cf r e s hw e i g h t i n c r e a s ea n d s u i t a b l ef o rt t a m g e n i c sT h e s e a s i t i v i t I e so f l i t c h iE C t oh y g r o m y c i nBa n dk a n a m v c

10、m w e r e e v a l u a t e dt h r e u } g ht h em e t h o d o f t h em e a s u r e m e n to f f r e s hw e i 曲ti n c r e a s ec o m b i n e dw i t h q u a l i t a t i v e o b s e r v a t i o n , w h i c hs h o w e dt h a

11、t l i t c h i E Cw e r e n o t s e n s i t i v e t ok a u a m y c i nb u ts e n s i t i v et oh y g r o m y u i aB H y g r o m y c i n1 3 o b v i o u s l yd e p r e s s e dt h eg r o w t ho fI i t c h i E C ．w h i c hw a

12、 sm o r t a l t o t h e m T h ec o n c e n t r a t i o no f5 0m 磯f o r h y g r m n y c i nBw a sp m v e d t o b e s u i t a h l e f o r l i t c h i E C t m u s g e n i e s e l e c t i o n t h r o u g h f u r l h e r e x

13、p e t i m e n t s3 ) 弧e o 砸m a lp a r a m e t e r su s e di nl i t c h iE C b o m b a r d m e n t w e r eo b t a i n e d L i t c h iE Cw e r eb o m b a r d e d u s i n gt h ep h i s m i dp C A M B [ 0 1 3 0 1i n c l u d

14、i n gg u sa M h p tg e n e s ，a n d t h ep a r a m e t e r sa f f e c t i n gh o m b m d m e n t w e r eo p t i m i z e d 、T M r e s u l t ss h e w e d t h a tt h e b e s tt r a n s i e a te x p r e s s i o no fG U S w a

15、 so b t a i n e dw h e nl l t c h iE CW e r eb o m b a r d e d w i t ht h ef o l l o w m gp r o c e d u r e s ：l i t c h iE Cp r e ·c u l t u r e df o r5 - 1 0d a y s w e r et r a n s f e r r e do n t ot h eo s m o

16、t i cm e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t h0 ．2 5m e l 幾m a n i n t o lf o r4h o u r ．1 0 n gp r e - t r e a t m e n t ia n d t h e n t h e yw e r eb o m b a r d e d o n et i m ea f t e rt h ep r e p a r a t i o no f

17、p a r t i c l e - p l a s m i dc o m p o u n d s w a g p e f f o m e d u s i n g 0 ．5u g p l a s m i dD N A a n d 6 0 0 u gg o l d m i c r o p a r t i e l e s p e r s h o o t u n d e r t h e c o n d i t i o n s o f l l O

18、 Op s i h e l i u m p r e s s u r e a n d 6 c m s h o o t i n gd i s t a n c e ；a n d ‰a l b ' e ⅡI t u m d o n t h e s a I m e o s m o t i c m e d i u m a sa b o v e f o r a n o t h e r l 6 h o u r s4 1A w h o l e t

19、 e c h n i c a ls v s t e mo f l l t c h ir e s i s t a mc a l l is e l e e t i o n ．s o m a t i ce m b e c o g e u e s i s f r o mr e s i s t a n tc e l ll i n e s ，t r a n s g e i n cp l a n tr e g e n e r a t i o na n

20、 d t m a s g e n i ca s s a yw a s e s t a b l i s h e d A f t e rt h eb o m b a r d e d l i t c h iE Cw e r es e l e c t e de l lM S m e d i u m s u p p l e m e n t e dw i t h5 0m e - ／Lh v g r o m y c i n B ．s o m e9 0

21、r e s i s t a n te e l l l i n e sw e r eo b t a i n e d ．a(chǎn) n df i n a l l y 7 e e l ll i n e sw e r em a i n t a i n e df o rf o i t h e rs t u d i e st h r o u g h t h eo p t i m i z a t i o n o fc u l t u r ec o n d i

22、 t i o n sa n d f u r t h e rs e l e c t i n gp r o c e d u r e s G u s a n dh p tg e n eh a d b o t hi n t 6 n a t e d i n t ot h eg e n o m eo f 也e 7r e s i s t a n tc e l ll i n e sp r o v e db yP C R a s s a y sa n d

23、a m o n g t h e m ．4r e s i s t a n t c e l l l i n e s s t e a d i l y e x p r e s s e dt h eG U Se n z y m ep r e y e db y G U Sh i s t o c h e m i c a l a s s a y s A b o u t3 0 p l a n t l e t s r e g e n e r a t e d