米氏常數(shù)測定方法

1、酶活米氏常數(shù)實驗一、實驗前準備1、24 孔板洗凈烘干，準備足夠槍頭。2、準備催化劑，在光下呈透明狀為分散性較好，否則用超聲清洗器（位于化學間）超聲分散 5min，期間準備底物（如 TMB 或者 ABTS） ，濃度依照自己實驗的要求定（10mg/mL 或 5mg/mL） ，一般 1mL 足夠用，可在 1.5mL 離心管中溶解。TMB（外間冰箱上層）溶于 DMSO（二甲亞砜，位于化學間王春雨的柜子里） ，ABTS（與 TMB 放在一起）溶于

2、二次水。3、將緩沖液、催化劑、底物、H2O2、200µL 和 10µL 移液槍、50µL 排槍（位于稱量處上方模擬酶專用槍的柜中） 、96 孔板、24 孔板、卷紙一起放入紙盒中，放到對面酶標儀前，開空調(diào)定室溫（25℃，提醒其他人隨手關(guān)門） ，24 孔板中其中一排加入適量 H2O2（每孔 1mL 左右，注意避光，可在板上蓋一張卷紙） ，將緩沖液、催化劑、底物放實驗臺上，靜置 0.5-1h。4、記錄本上提前寫好

3、實驗的加樣順序：催化底物 TMB（或 ABTS）的酶促動力學過程加樣順序：①200µL 緩沖液 ②10µL 催化劑 ③底物 TMB（ABTS）(0，0.5，1，2，4，6，8，10µL) ④32µLH2O2（排槍加）催化底物 H2O2 的酶促動力學過程加樣順序：①200µL 緩沖液 ②10µL 催化劑 ③H2O2（2，4，6，8，10，16，32，64µL） ④10

4、µL 底物 TMB（ABTS） （排槍加） 數(shù)據(jù)記錄按下表記，Code 為每次讀板時的微孔板編號，Time 為對應的讀板時的時間，一般 30s 讀板一次，可根據(jù)反應的快慢來確定讀板的時間。Code 1 2 3 4 5 6 7TimeTMB 0 0.5 1 2 4 6 8 10V01Code 1 2 3 4 5 6 7TimeH2O2 2 4 6 8 10 16 32 64V01二、實驗1、打開酶標儀（開關(guān)在儀器后部，若儀器沒反