庫(kù)德畢赤酵母重金屬積累特性及高鹽-低pH下鎘抗性提高機(jī)理研究.pdf

1、水環(huán)境中重金屬污染導(dǎo)致水產(chǎn)品中重金屬超標(biāo)問(wèn)題時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重影響人體健康。微生物對(duì)重金屬的生物積累作用是目前重金屬脫除研究的熱點(diǎn)之一，活性微生物具有在復(fù)雜食品物料體系如液態(tài)水產(chǎn)制品中脫除重金屬的能力。良好的重金屬抗性和積累特性是應(yīng)用該方法的必要前提，是活性微生物脫除重金屬的重要保障。本文系統(tǒng)研究了多抗性庫(kù)德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii A16）的重金屬（鎘、銅和鋅）抗性、積累特性和脫除能力，研究了高鹽或低pH對(duì)P.ku

2、driavzeviiA16重金屬抗性、積累特性和脫除能力的影響，并對(duì)高鹽或低pH條件下P.kudriavzeviiA16鎘抗性提高機(jī)理進(jìn)行了深入的探討。
　　1.以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae CICC1211）為對(duì)照菌株，系統(tǒng)研究了P.kudriavzeviiA16的重金屬（鎘、銅和鋅）抗性、積累特性和脫除能力。結(jié)果表明，P.kudriavzevii A16具有很高的鎘、銅和鋅抗性與積累特性，并且對(duì)

3、鎘和鋅具有很強(qiáng)的脫除能力，對(duì)于低于0.04 mmol/L的鎘和0.1 mmol/L鋅的脫除率均超過(guò)95％。這兩株酵母對(duì)某一種重金屬的積累作用明顯受到其它重金屬離子的影響，銅和鋅離子顯著降低兩株酵母的單位菌體鎘積累量，鎘和鋅離子明顯提高兩株酵母的單位菌體銅積累量，P.kudriavzeviiA16的單位菌體鋅積累量在鎘和銅離子作用下顯著下降，而S.cerevisiae CICC1211的卻有所提高。在相同積累時(shí)間、初始重金屬濃度和初始菌體

4、濃度或其它重金屬離子存在的條件下，P.kudriavzeviiA16的重金屬脫除能力均顯著高于S.cerevisiae CICC1211。
　　2.為了明確高鹽或低pH條件下活性P.kudriavzevii A16在重金屬（鎘、銅和鋅）脫除上的應(yīng)用潛力，以S.cerevisiae CICC1211為對(duì)照菌株，分別系統(tǒng)研究了高鹽或低pH對(duì)P.kudriavzevii A16重金屬抗性、積累特性和脫除能力的影響。結(jié)果表明，高鹽或低pH

5、顯著提高兩株酵母的鎘抗性，這可能與單位菌體鎘積累量特別是細(xì)胞內(nèi)鎘積累量的顯著下降有很大關(guān)系。與對(duì)鎘抗性的影響完全不同，高鹽或低pH條件下兩株酵母的銅抗性顯著下降，單位菌體銅積累量特別是細(xì)胞內(nèi)銅積累量的顯著上升對(duì)其銅抗性的下降可能有很大影響。兩株酵母的鋅抗性無(wú)顯著變化，然而兩株酵母的單位菌體鋅積累量均有所提高。與對(duì)S.cerevisiaeCICC1211的影響不同，高鹽或低pH并沒(méi)有明顯降低活性P.kudriavzeviiA16的鎘、銅和

6、鋅脫除能力，反而在某些條件下提高了其脫除能力。在高鹽或低pH下，P.kudriavzevii A16對(duì)鎘、銅和鋅的脫除能力均顯著高于S.cerevisiae CICC1211。
　　3.采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究高鹽或低pH下P.kudriavzeviiA16的鎘抗性提高機(jī)理。運(yùn)用RNA-Seq結(jié)合de novo組裝技術(shù)在轉(zhuǎn)錄組水平上研究高鹽-鎘脅迫與鎘脅迫、低pH-鎘脅迫與鎘脅迫等條件下P.kudriavzeviiA16的基因表達(dá)差異

7、，選擇FPKM值為4倍差異變化且FDR＜0.001的轉(zhuǎn)錄本作為差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行功能注釋和分析。高鹽-鎘脅迫與鎘脅迫之間共篩選出差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本62個(gè):涉及抗氧化活性、應(yīng)激反應(yīng)、甘油運(yùn)輸、電子傳遞等功能的23個(gè)轉(zhuǎn)錄本在高鹽-鎘脅迫中表達(dá)量上調(diào)，而涉及跨膜運(yùn)輸、核糖體生物合成、轉(zhuǎn)錄相關(guān)功能、細(xì)胞壁合成等功能的39個(gè)轉(zhuǎn)錄本在高鹽-鎘脅迫中表達(dá)量下調(diào)。低pH-鎘脅迫與鎘脅迫之間共篩選出的61個(gè)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本:涉及應(yīng)激反應(yīng)、甘油運(yùn)輸、電子傳遞、抗

8、氧化活性等功能的32個(gè)轉(zhuǎn)錄本在低pH-鎘脅迫中表達(dá)量上調(diào)，而涉及跨膜運(yùn)輸、核糖體生物合成、轉(zhuǎn)錄相關(guān)功能、細(xì)胞壁合成等功能的29個(gè)轉(zhuǎn)錄本在低pH-鎘脅迫中表達(dá)量下調(diào)。
　　4.運(yùn)用雙向凝膠電泳(2-DE)研究高鹽或低pH對(duì)鎘脅迫下P.kudriavzeviiA16蛋白質(zhì)組的影響。對(duì)比各組每個(gè)蛋白點(diǎn)的豐度，選擇2倍差異變化的蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定和功能分析。高鹽-鎘脅迫與鎘脅迫之間共鑒定出差異表達(dá)蛋白點(diǎn)39個(gè):涉及物質(zhì)代謝和能量生成、核糖

9、體合成與轉(zhuǎn)錄、抗氧化活性等功能的28個(gè)蛋白點(diǎn)在高鹽-鎘脅迫中表達(dá)量上調(diào)，而涉及物質(zhì)代謝、跨膜運(yùn)輸?shù)裙δ艿?1個(gè)蛋白點(diǎn)在高鹽-鎘脅迫中表達(dá)量下調(diào)。低pH-鎘脅迫與鎘脅迫共鑒定出差異表達(dá)蛋白點(diǎn)21個(gè):涉及物質(zhì)代謝、抗氧化活性等功能的11個(gè)蛋白點(diǎn)在低pH-鎘脅迫中表達(dá)量上調(diào)，而涉及物質(zhì)代謝、跨膜運(yùn)輸?shù)裙δ艿?0個(gè)蛋白點(diǎn)在低pH-鎘脅迫中表達(dá)量下調(diào)。
　　5.運(yùn)用SYBR Green qRT-PCR技術(shù)對(duì)與P.kudriavzevii A

10、16鎘抗性提高相關(guān)的關(guān)鍵基因進(jìn)行定量分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高鹽或低pH均能顯著提高P.kudriavzeviiA16鎘脅迫下SODC、SODM、PRX1、PRX2D、CATA等抗氧化物酶基因的表達(dá)?？寡趸锩富盍ψ兓c基因表達(dá)的變化一致，高鹽或低pH下P.kudriavzeviiA16的T-SOD、POD和CAT活力均明顯高于單獨(dú)鎘脅迫下的活力。抗氧化物酶基因的大量表達(dá)在降低鎘脅迫下P.kudriavzevii A16細(xì)胞內(nèi)ROS含量、細(xì)胞死

11、亡率、細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化水平、蛋白質(zhì)氧化損傷水平等方面發(fā)揮了很大作用，是P.kudriavzeviiA16鎘抗性提高的重要原因。此外，高鹽或低pH均能顯著提高鎘脅迫下P.kudriavzeviiA16中YCF1、GST、HSP12、RAD57等基因的表達(dá)，而這些基因的大量表達(dá)對(duì)于降低鎘毒性、降低氧化脅迫、維持細(xì)胞穩(wěn)定發(fā)揮了重要作用。
　　重金屬污染是水產(chǎn)品中最為嚴(yán)重的安全問(wèn)題之一，目前還沒(méi)有很成熟的方法用于解決水產(chǎn)品中重金屬超標(biāo)問(wèn)題