重金屬鎘影響黃花蒿次生代謝產(chǎn)物積累的分子機(jī)理研究.pdf

1、青蒿來源于菊科蒿屬一年生草本植物黃花蒿(Artemisia annuaL.)的干燥地上部分，為我國的傳統(tǒng)中藥，其主要活性成分是倍半萜內(nèi)酯化合物青蒿素。主要用于瘧疾，其作用機(jī)理是改變瘧原蟲膜系結(jié)構(gòu)，最終使瘧原蟲死亡。目前，首選途徑依然是通過人工栽培并從黃花蒿原植物中提取分離青蒿素。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)小劑量鎘能夠促進(jìn)青蒿素的積累。本論文通過多劑量鎘脅迫黃花蒿，研究其對(duì)黃花蒿體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物積累規(guī)律及次生代謝產(chǎn)物合成途徑中關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影

2、響。另外，通過差異表達(dá)分析在MAPK家族中篩選與鎘脅迫有關(guān)的MAPK基因，以初步探討黃花蒿中MAPK級(jí)聯(lián)途徑在鎘信號(hào)傳導(dǎo)過程中的作用及其對(duì)次生代謝產(chǎn)物積累的影響。
　　本論文主要研究成果如下:
　　1.黃花蒿種苗個(gè)體差異性研究通過觀察株高、長(zhǎng)勢(shì)、葉片顏色以及青蒿素等次生代謝產(chǎn)物的含量，考察實(shí)驗(yàn)所用材料的個(gè)體差異性。結(jié)果提示在進(jìn)行Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)選取植株株高、長(zhǎng)勢(shì)及葉片顏色相同且健壯的種苗作為實(shí)驗(yàn)材料。

3、　　2.重金屬鎘對(duì)黃花蒿體內(nèi)青蒿素等次生代謝產(chǎn)物積累的影響將Cd(NO3)2·4H2O添加到營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)黃花蒿，采用LC-MS方法檢測(cè)多濃度鎘處理黃花蒿1d和3d后，地上部分青蒿素、青蒿酸、青蒿乙素和二氫青蒿酸含量并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示:處理3d后，青蒿素（60、80、120μM處理組）、青蒿酸（60、120μM處理組）、青蒿乙素（120μM處理組）的含量分別與對(duì)照組相比在P＜0.05水平均存在顯著差異，而二氫青蒿酸的含量與對(duì)照組相比

4、未表現(xiàn)出顯著差異。實(shí)驗(yàn)表明，重金屬鎘能顯著提高青蒿素、青蒿酸和青蒿乙素的含量。
　　3.重金屬鎘誘導(dǎo)下黃花蒿內(nèi)參基因穩(wěn)定性研究選取黃花蒿的Actin、18S rRNA、PAL、GAPDH和CPR作為候選內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)特異性引物，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR，利用geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta CT以及RefFinder軟件和方法對(duì)5種內(nèi)參基因在不同濃度鎘處理下黃花蒿葉片中的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析，為黃花

5、蒿基因差異表達(dá)研究提供可靠的內(nèi)參基因，確保黃花蒿基因表達(dá)分析結(jié)果的可靠性。結(jié)果表明在不同濃度鎘處理下，黃花蒿葉片中候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性存在差異，綜合分析得出候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性順序依次為Actin＞18S rRNA＞PAL＞GAPDH＞CPR。
　　4.重金屬鎘誘導(dǎo)下青蒿素合成途徑中關(guān)鍵酶基因差異表達(dá)研究通過Real-Time PCR的方法對(duì)黃花蒿在不同濃度鎘處理下青蒿素合成途徑中關(guān)鍵酶基因HMGR、FPS、ADS、CYP7

6、1AV1、CPR、ALDH1、DBR2、DXS和DXR進(jìn)行差異表達(dá)分析。結(jié)果顯示，在鎘處理下ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1的表達(dá)量在4，8h相對(duì)于CK組都有很大的提高，表示這些基因能很快響應(yīng)鎘刺激。表明了在鎘誘導(dǎo)下ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1四個(gè)基因是影響青蒿素等次生代謝產(chǎn)物積累的關(guān)鍵酶基因。
　　5.重金屬鎘誘導(dǎo)下信號(hào)傳導(dǎo)MAPKs基因的差異表達(dá)研究拼接SRA數(shù)據(jù)中黃花蒿EST序列得到Unige