菊芋乙醇發(fā)酵策略及菊粉酶表達調(diào)控機制研究.pdf

1、生物能源能夠緩解能源危機，促進人類的可持續(xù)發(fā)展。燃料乙醇已實現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，為全面推進能源結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)型奠定了基礎(chǔ)。發(fā)展非糧作物乙醇是中國燃料乙醇的重要發(fā)展方向。菊芋以其耐寒、耐旱、抗風(fēng)沙、繁殖力強、保持水土等生長特性，成為現(xiàn)階段非糧作物乙醇的研究焦點。與淀粉質(zhì)原料相比，菊芋乙醇發(fā)酵過程面臨發(fā)酵時間長和殘?zhí)菨舛雀叩入y題，這在很大程度上限制了菊芋乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)。本論文的研究工作揭示了菊芋乙醇發(fā)酵過程中存在問題的根本原因，并通過過程工程調(diào)

2、控策略和菊粉酶表達調(diào)控機制的探究，解決了這些問題，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
　　首先，研究工作評價了恒定通氣調(diào)控策略對乙醇發(fā)酵性能的影響。恒定通氣條件（0.25和0.5 vvm）能夠顯著加快發(fā)酵過程，降低發(fā)酵終點的殘?zhí)菨舛龋掖紳舛群鸵掖嫉寐示艿捷^為明顯的影響。不通氣條件雖保持了較高的乙醇得率，但是發(fā)酵時間明顯延長，發(fā)酵過程菊粉酶活力不足，而且發(fā)酵終點殘?zhí)菨舛冗^高;為了解決通氣與高乙醇得率之間的矛盾，我們提出兩階段通氣策略（

3、發(fā)酵前12h，通氣量維持在0.25 vvm左右，之后維持在0.06 vvm直至終點），顯著加快了發(fā)酵過程(縮短36h)，乙醇濃度達到了97.97 g/L，乙醇生產(chǎn)強度達到1.63 g/L/h，發(fā)酵終點的殘?zhí)菨舛冉档偷?2 g/L以下（糖利用率超過95％）。在此基礎(chǔ)上，研究了菊芋塊莖真實物料為底物的乙醇發(fā)酵過程。與不通氣相比，兩階段通氣策略同樣能夠加快發(fā)酵過程，縮短發(fā)酵時間24h，乙醇生產(chǎn)強度提高60％，發(fā)酵終點的殘?zhí)菨舛扔?0.8 g/

4、L降到13.8 g/L。
　　其次，研究了不同氧化還原電位（ORP）調(diào)控對乙醇發(fā)酵的影響。對菊芋乙醇發(fā)酵過程而言，ORP調(diào)控策略是一種更有效、更精細的通氣量控制手段。與“兩階段通氣策略”相比，在最優(yōu)的ORP調(diào)控(-130 mV)條件下，能夠獲得更高的乙醇生產(chǎn)強度(1.63和2.04 g/L/h)和更低的殘?zhí)菨舛龋?2和6 g/L）;同時，通過擴大接種量和增加初始菊粉酶活性的研究，證實了通氣對乙醇發(fā)酵過程的促進作用的根本原因在于菊粉

5、酶活力以及細胞活性的提高。
　　再次，對馬克斯克魯維酵母不同乙醇發(fā)酵條件下的轉(zhuǎn)錄組學(xué)進行了分析，分別比較了高糖與低糖、通氣與不通氣條件下基因的差異表達情況。獲得的差異表達基因主要涉及中心碳代謝、糖轉(zhuǎn)運體系和氧化防御途徑等。分析結(jié)果表明在高底物濃度及高氧化壓力環(huán)境下，氧化防御途徑以及細胞自噬等關(guān)鍵基因?qū)S持細胞活性至關(guān)重要。在此基礎(chǔ)上，通過基因的過表達，驗證了幾個關(guān)鍵基因?qū)σ掖及l(fā)酵和細胞存活的重要作用。以過氧化物氧化還原酶（KmTP

6、X1）、硫氧還蛋白(KmTRX)和硫氧還蛋白還原酶（KmTrxR）為代表的氧化還原酶對細胞在惡劣條件下生長以及乙醇生成具有促進作用，解釋了馬克斯克魯維酵母在高糖和高氧化壓力條件下良好乙醇發(fā)酵性能的根本原因。更為重要的是，這些氧化還原酶，特別是KmTPX1，能夠提高細胞對氧化壓力、甲酸、乙酸和乙醇等多種環(huán)境脅迫因子的耐受能力，促進酵母細胞在惡劣條件下的乙醇發(fā)酵性能，為進一步應(yīng)用于纖維素乙醇等領(lǐng)域奠定了基礎(chǔ)。
　　最后，針對菊芋乙醇發(fā)

7、酵過程中菊粉酶表達量低的問題，探討了菊粉酶的表達調(diào)控機制。一方面，菊粉酶活力受菊粉誘導(dǎo)和高濃度碳源的抑制作用。通氣量和乙醇添加通過影響細胞生長影響菊粉酶的活性。另一方面，研究工作以菊粉酶啟動子為出發(fā)點，闡述了碳源對其調(diào)控機制。研究結(jié)果表明，盡管活性存在差異，不同長度的菊粉酶啟動子受菊粉誘導(dǎo)和高濃度葡萄糖的抑制作用。353 bp長度的菊粉酶啟動子表現(xiàn)出最強的啟動活性，并受到最弱的碳源抑制作用，對其進一步的截斷實驗表明，核心啟動區(qū)域位于起始

8、密碼子上游-271～-110 bp之間。而菊粉酶啟動子所受到的抑制作用主要源于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Mig1，其結(jié)合位點位于起始密碼子上游-485～-496 bp處。同時，通過353 bp菊粉酶啟動子的隨機突變實驗，獲得了活性提高2倍以上的突變啟動子，為后續(xù)進一步提高發(fā)酵過程中的菊粉酶活性奠定了基礎(chǔ)。
　　綜上，“兩階段通氣策略”和“ORP調(diào)控策略”改善了目前菊芋乙醇發(fā)酵領(lǐng)域存在的發(fā)酵時間長、殘?zhí)歉叩膯栴};轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析揭示了通氣策略有助于發(fā)