菊芋乙醇發(fā)酵策略及菊粉酶表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、生物能源能夠緩解能源危機(jī)，促進(jìn)人類的可持續(xù)發(fā)展。燃料乙醇已實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，為全面推進(jìn)能源結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)型奠定了基礎(chǔ)。發(fā)展非糧作物乙醇是中國(guó)燃料乙醇的重要發(fā)展方向。菊芋以其耐寒、耐旱、抗風(fēng)沙、繁殖力強(qiáng)、保持水土等生長(zhǎng)特性，成為現(xiàn)階段非糧作物乙醇的研究焦點(diǎn)。與淀粉質(zhì)原料相比，菊芋乙醇發(fā)酵過程面臨發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)和殘?zhí)菨舛雀叩入y題，這在很大程度上限制了菊芋乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)。本論文的研究工作揭示了菊芋乙醇發(fā)酵過程中存在問題的根本原因，并通過過程工程調(diào)

2、控策略和菊粉酶表達(dá)調(diào)控機(jī)制的探究，解決了這些問題，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
　　首先，研究工作評(píng)價(jià)了恒定通氣調(diào)控策略對(duì)乙醇發(fā)酵性能的影響。恒定通氣條件（0.25和0.5 vvm）能夠顯著加快發(fā)酵過程，降低發(fā)酵終點(diǎn)的殘?zhí)菨舛?，但乙醇濃度和乙醇得率均受到較為明顯的影響。不通氣條件雖保持了較高的乙醇得率，但是發(fā)酵時(shí)間明顯延長(zhǎng)，發(fā)酵過程菊粉酶活力不足，而且發(fā)酵終點(diǎn)殘?zhí)菨舛冗^高;為了解決通氣與高乙醇得率之間的矛盾，我們提出兩階段通氣策略（

3、發(fā)酵前12h，通氣量維持在0.25 vvm左右，之后維持在0.06 vvm直至終點(diǎn)），顯著加快了發(fā)酵過程(縮短36h)，乙醇濃度達(dá)到了97.97 g/L，乙醇生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到1.63 g/L/h，發(fā)酵終點(diǎn)的殘?zhí)菨舛冉档偷?2 g/L以下（糖利用率超過95％）。在此基礎(chǔ)上，研究了菊芋塊莖真實(shí)物料為底物的乙醇發(fā)酵過程。與不通氣相比，兩階段通氣策略同樣能夠加快發(fā)酵過程，縮短發(fā)酵時(shí)間24h，乙醇生產(chǎn)強(qiáng)度提高60％，發(fā)酵終點(diǎn)的殘?zhí)菨舛扔?0.8 g/

4、L降到13.8 g/L。
　　其次，研究了不同氧化還原電位（ORP）調(diào)控對(duì)乙醇發(fā)酵的影響。對(duì)菊芋乙醇發(fā)酵過程而言，ORP調(diào)控策略是一種更有效、更精細(xì)的通氣量控制手段。與“兩階段通氣策略”相比，在最優(yōu)的ORP調(diào)控(-130 mV)條件下，能夠獲得更高的乙醇生產(chǎn)強(qiáng)度(1.63和2.04 g/L/h)和更低的殘?zhí)菨舛龋?2和6 g/L）;同時(shí)，通過擴(kuò)大接種量和增加初始菊粉酶活性的研究，證實(shí)了通氣對(duì)乙醇發(fā)酵過程的促進(jìn)作用的根本原因在于菊粉

5、酶活力以及細(xì)胞活性的提高。
　　再次，對(duì)馬克斯克魯維酵母不同乙醇發(fā)酵條件下的轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行了分析，分別比較了高糖與低糖、通氣與不通氣條件下基因的差異表達(dá)情況。獲得的差異表達(dá)基因主要涉及中心碳代謝、糖轉(zhuǎn)運(yùn)體系和氧化防御途徑等。分析結(jié)果表明在高底物濃度及高氧化壓力環(huán)境下，氧化防御途徑以及細(xì)胞自噬等關(guān)鍵基因?qū)S持細(xì)胞活性至關(guān)重要。在此基礎(chǔ)上，通過基因的過表達(dá)，驗(yàn)證了幾個(gè)關(guān)鍵基因?qū)σ掖及l(fā)酵和細(xì)胞存活的重要作用。以過氧化物氧化還原酶（KmTP

6、X1）、硫氧還蛋白(KmTRX)和硫氧還蛋白還原酶（KmTrxR）為代表的氧化還原酶對(duì)細(xì)胞在惡劣條件下生長(zhǎng)以及乙醇生成具有促進(jìn)作用，解釋了馬克斯克魯維酵母在高糖和高氧化壓力條件下良好乙醇發(fā)酵性能的根本原因。更為重要的是，這些氧化還原酶，特別是KmTPX1，能夠提高細(xì)胞對(duì)氧化壓力、甲酸、乙酸和乙醇等多種環(huán)境脅迫因子的耐受能力，促進(jìn)酵母細(xì)胞在惡劣條件下的乙醇發(fā)酵性能，為進(jìn)一步應(yīng)用于纖維素乙醇等領(lǐng)域奠定了基礎(chǔ)。
　　最后，針對(duì)菊芋乙醇發(fā)

7、酵過程中菊粉酶表達(dá)量低的問題，探討了菊粉酶的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。一方面，菊粉酶活力受菊粉誘導(dǎo)和高濃度碳源的抑制作用。通氣量和乙醇添加通過影響細(xì)胞生長(zhǎng)影響菊粉酶的活性。另一方面，研究工作以菊粉酶啟動(dòng)子為出發(fā)點(diǎn)，闡述了碳源對(duì)其調(diào)控機(jī)制。研究結(jié)果表明，盡管活性存在差異，不同長(zhǎng)度的菊粉酶啟動(dòng)子受菊粉誘導(dǎo)和高濃度葡萄糖的抑制作用。353 bp長(zhǎng)度的菊粉酶啟動(dòng)子表現(xiàn)出最強(qiáng)的啟動(dòng)活性，并受到最弱的碳源抑制作用，對(duì)其進(jìn)一步的截?cái)鄬?shí)驗(yàn)表明，核心啟動(dòng)區(qū)域位于起始

8、密碼子上游-271～-110 bp之間。而菊粉酶啟動(dòng)子所受到的抑制作用主要源于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Mig1，其結(jié)合位點(diǎn)位于起始密碼子上游-485～-496 bp處。同時(shí)，通過353 bp菊粉酶啟動(dòng)子的隨機(jī)突變實(shí)驗(yàn)，獲得了活性提高2倍以上的突變啟動(dòng)子，為后續(xù)進(jìn)一步提高發(fā)酵過程中的菊粉酶活性奠定了基礎(chǔ)。
　　綜上，“兩階段通氣策略”和“ORP調(diào)控策略”改善了目前菊芋乙醇發(fā)酵領(lǐng)域存在的發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)、殘?zhí)歉叩膯栴};轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析揭示了通氣策略有助于發(fā)