PLGA-TCP支架材料的不同三維空間結構對骨缺損部位神經化影響的研究.pdf

1、骨缺損，作為直接或間接暴力所導致的嚴重骨組織損傷，一直是骨科學界研究的重點和難點。尤其是近十年間，隨著地震傷、交通傷和骨腫瘤病人的日益增加，由此導致的大段骨缺損病人的治療、預后和并發(fā)癥等更加成為困擾骨外科醫(yī)生的難題。因此，摸索出一條有效促進缺損修復的方法已成為骨科學術界不得不面臨的問題之一。早期，在治療骨缺損過程中，往往采用傳統(tǒng)的手術和外固定架等方法對骨缺損病人進行治療。這些治療方法雖然對小段骨缺損效果較明顯，但對大段骨缺損的治療效果并

2、不理想。隨著組織工程學治療理念的提出和發(fā)展，為解決骨缺損尤其是大段骨缺損的修復治療問題提供了有力的契機。近年來，骨組織工程的研究在動物體內實驗中雖取得了一定的成果，但總體仍停留在實驗室水平。實驗最終在新生骨組織形成的數(shù)量和質量上均遠未達到預期的效果，臨床應用與傳統(tǒng)治療方法相比優(yōu)勢并不明顯。因此尋找能夠有效提高大段骨缺損修復的方法是目前亟待解決的難題。
　　血管化作為近年來組織工程骨研究中的一個熱點問題。國內外學者均取得了喜人的研究

3、成果。支架材料的結構因素對于組織工程骨的血管化影響已經得到了證實。具有良好孔間連通的孔隙結構有利于組織工程骨的血管化。這些成果雖然一定程度上解決了組織工程骨的血管化問題，但在修復效果上仍不理想，主要表現(xiàn)為材料的力學性能較差等問題，距離臨床應用還有差距。因此，考慮在骨組織工程研究當中是否還有其它關鍵的問題尚待解決呢？進行了大量文獻閱讀和預實驗后發(fā)現(xiàn)，在正常的骨組織和髓腔內有大量的神經纖維分布，神經調節(jié)在骨的正常代謝及改建中起到了重要的作用

4、。骨折部位在缺乏神經支配的情況下，雖然有骨痂生長，但相對于正常的骨折再生骨痂來說，其質量和生物力學強度均明顯不足。因此，考慮組織工程骨的神經再支配，即組織工程骨的神經化問題可能是組織工程骨修復過程中的一個關鍵環(huán)節(jié)。這一問題也許就是解決和完善組織工程骨修復質量的新靶點。
　　隨著材料-生物學的發(fā)展，支架材料作為組織工程三要素中最為重要的組成部分，已被證實其特殊的三維空間結構對于組織工程骨的成骨和血管化均有重要影響。有研究發(fā)現(xiàn)，支架材

5、料的三維空間結構可以影響局部功能細胞的粘附、增殖和遷移，具有定向結構的支架材料更有助于體內周圍神經再生。因此，設想支架材料的三維空間結構有可能通過影響神經功能細胞的遷移、增殖進而影響組織工程骨神經化的進程，最終影響骨組織的再生修復。
　　綜上所述，本實驗采用低溫沉積技術制備出具有不同三維空間結構的PLGA/TCP支架材料。在體外復合細胞后，觀察具有神經功能的雪旺細胞是否會因三維空間結構的變化影響其增殖、粘附及分化等生物學行為。在體

6、內將支架材料植入動物股骨髁部缺損后，觀察缺損部位神經的長入情況和組織修復情況，找到最適合神經化的支架材料結構并探討其作用機制。具體研究內容如下：
　　第一部分利用低溫沉積技術制備不同孔徑的PLGA/TCP支架材料
　　方法：采用低溫沉積技術制備出具有不同孔徑和孔隙率的PLGA/TCP支架材料。應用掃描電子顯微鏡（SEM）對大孔徑和小孔徑支架材料的孔徑和孔隙率進行觀察測量并對支架材料的親水性和生物力學性能進行檢測和比較。最后，

7、通過正常培養(yǎng)基與支架材料浸提液的對比試驗，檢測材料的細胞毒性。
　　結果：大孔徑組的孔徑和孔隙率明顯大于小孔組。低溫沉積結合3D打印制備的PLGA/TCP支架材料的平均吸水率為2.2％±0.1%。細胞毒性檢測結果顯示，材料浸提液的PH值變化不大；與正常培養(yǎng)基組相比，細胞生存率有所下降。
　　結論：低溫沉積技術制備的不同孔徑的PLGA/TCP支架材料基本滿足實驗需要。大孔徑和小孔徑支架材料達到實驗對孔徑和孔隙率的要求。材料親水

8、性較好有利于細胞的粘附。細胞毒性檢測材料PH值適宜細胞生長。細胞生存率有所下降，考慮與材料的有機溶劑1，4-二氧六環(huán)有關。
　　第二部分體外比較不同孔徑結構的PLGA/TCP支架材料對雪旺細胞的影響
　　方法：選擇1-3天 SD大鼠乳鼠，從其體內截取坐骨和臂叢神經進行雪旺細胞（Schwann Cells， SCs）原代培養(yǎng)并取Ⅱ代細胞進行純化。通過滴注法，將純化后的雪旺細胞接種于不同孔徑的PLGA/TCP支架上。利用掃描電鏡

9、觀察細胞在不同孔徑PLGA/TCP支架材料上的粘附形態(tài)和生長情況；BrdU標記不同孔徑PLGA/TCP支架材料上細胞繁殖情況；CCK-8法檢測不同孔徑PLGA/TCP支架材料上細胞的增殖情況；酶聯(lián)免疫法（Elisa）和RT-PCR檢測法觀察不同孔徑PLGA/TCP支架材料上SCs分泌的神經生長因子（NGF）、神經膠質細胞源神經生長因子（GDNF）和神經細胞粘附分子（Ncam）的表達差異。
　　結果：掃描電鏡結果顯示材料表面微孔明顯

10、，大孔徑組孔徑周邊生長的細胞增殖、遷移均明顯優(yōu)于小孔徑組，但小孔徑組上的細胞黏附性更強。激光共聚焦顯微鏡觀察BrdU染色結果顯示大孔徑組孔徑周圍的細胞數(shù)量明顯多于小孔徑組。CCK-8結果顯示24h兩組細胞增殖未見顯著差異。48h后，大孔徑組細胞增殖明顯優(yōu)于小孔徑組。酶聯(lián)免疫法和RT-PCR檢測結果顯示，隨著時間的增加，大孔徑組NGF、GDNF和Ncam的表達均高于小孔徑組。
　　結論：孔徑在100-300μm的支架材料復合SCs后

11、，雖然早期刺激了細胞的增殖、遷移和分化，但最終因為材料本身結構的限制，SCs的細胞生物學行為受到抑制?？讖皆?00-600μm的支架材料復合 SCs后，早期雖然細胞基數(shù)不足，SCs釋放的神經營養(yǎng)因子數(shù)量較小孔徑組少，促細胞的增殖、遷移和分化能力也較弱，但隨著細胞數(shù)量逐步增加和材料本身的結構優(yōu)勢，促進了 SCs各項能力的提升。因此，具有不同三維空間結構的支架材料可以影響 SCs的細胞生物學行為，其中，大孔徑材料更有利于細胞的增殖、遷移和分

12、化能力的提升。同時，大孔徑材料的結構優(yōu)勢也有可能促進了局部的血管化和成骨效能。這就為體內觀察比較不同三維空間結構支架材料的神經化能力打下了理論基礎。
　　第三部分體內比較不同孔徑結構的 PLGA/TCP支架材料在修復兔股骨髁部骨缺損過程中的神經化研究
　　方法：將不同孔徑PLGA/TCP支架材料植入成年新西蘭大白兔股骨外上髁缺損部位，于術后2周、4周、8周和12周分別灌注后取材，然后應用掃描電鏡、免疫熒光染色、Bielsch

13、owshy染色和血清酶聯(lián)免疫等方法對樣本進行處理和觀察，探討不同三維空間結構的骨組織支架材料對缺損部位神經化和成骨的影響。
　　結果：術后大體觀察切口愈合良好且大部分動物均可正常活動。相同時間進行組間比較發(fā)現(xiàn)，大孔徑組較小孔徑組支架材料的降解速度快。組織學結果顯示2周至4周時骨膜進入孔徑內，其中大孔徑組孔徑內的骨膜組織多于小孔徑組。8周時，小孔徑組支架材料內的神經纖維數(shù)量明顯增加。免疫熒光染色結果顯示，術后早期，大孔徑組內神經遞質

14、及其受體表達明顯，而小孔徑組支架材料的孔徑內只有少量點狀分布的神經遞質表達。直至4周，小孔經組孔徑內才有大量神經遞質及其受體的陽性反應。8周至12周時，兩組新生骨組織周圍除神經肽類物質外，神經營養(yǎng)因子表達逐漸減弱。血清中神經肽類物質檢測結果顯示，2周至4周，除小孔徑組，大孔徑組和正常組的P物質和NPY的表達均升高。4周至8周，大孔徑組的NPY表達升高，小孔徑組表達未見顯著差異。8周至12周，大孔徑組P物質和NPY的表達明顯高于其他組。大

15、孔徑組在12周時的上升水平也較小孔徑組明顯。
　　結論：通過體內研究發(fā)現(xiàn)不同三維空間結構的PLGA/TCP支架材料中，大孔徑組支架材料具有良好的降解速度和骨膜誘導特性。與此同時，還證明了神經化程度與骨形成的速度是成正比的，神經化程度越高，神經遞質釋放越明顯，成骨速度越快。大孔徑組除具有良好的神經誘導性，還有很好的成骨作用。由于小孔徑支架材料的降解最終改變了其內部三維空間結構，促使材料內神經組織釋放出足夠多的神經遞質，從而加快了小孔