高山被孢霉原生質(zhì)體融合及全合成培養(yǎng)基研究.pdf

1、花生四烯酸(arachidonic acid，簡(jiǎn)稱(chēng)AA或ARA)在人體許多生理過(guò)程中起重要作用。作為一種重要的功能性油脂，在食品、藥品、保健品和化妝品等領(lǐng)域的需求正逐步增長(zhǎng)，市場(chǎng)前景繼續(xù)呈擴(kuò)大趨勢(shì)。利用高山被孢霉（Mortierellaalpina）發(fā)酵生產(chǎn)ARA因其ARA含量高、油脂組成合理等特點(diǎn)一直作為工業(yè)生產(chǎn)的主要方式。M.alpina是《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》(GB14880-2012)中生產(chǎn)ARA的指定菌種，

2、對(duì)其菌種進(jìn)行選育是提高ARA產(chǎn)量與品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一。
　　M.alpina的油脂組成直接影響到產(chǎn)品質(zhì)量，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)當(dāng)二十四碳烷酸（24C，木蠟酸）在總油脂中含量超過(guò)8％時(shí)，終產(chǎn)品油脂在低溫冷藏時(shí)析出白色沉淀物。因此，本課題利用自然雜交的育種方法對(duì)低24C菌種進(jìn)行了篩選。將24C及ARA含量均較低的一株野生菌YS-88447與生產(chǎn)用菌株G5進(jìn)行自然雜交育種，篩選獲得一株ZJ-3菌株，其24C含量為3.39％，對(duì)比生產(chǎn)菌株

3、（24C含量為9.16％）降低了170％;其ARA產(chǎn)量為5.21 g/L，對(duì)比生產(chǎn)菌株（ARA含量為4.86 g/L）提高了6.72％。
　　本課題探索并建立了Fe2+與磁場(chǎng)共同作用誘變M.alpina的方法，對(duì)G5進(jìn)行誘變后篩選得到一株油脂含量達(dá)44.85％的高產(chǎn)菌株C16，其ARA產(chǎn)量為6.43g/L，24C含量為8.98％。
　　為快速獲得高油脂含量、低24C的ARA高產(chǎn)菌株，加速育種過(guò)程，本課題利用原生質(zhì)體融合技術(shù)定

4、向篩選優(yōu)良性狀相結(jié)合的菌株。將上述獲得的優(yōu)良性狀菌株Z J-3和C16進(jìn)行原生質(zhì)體融合，對(duì)原生質(zhì)體制備及再生過(guò)程中相關(guān)因素進(jìn)行研究，確定了最佳條件。為提高融合子篩選效率和準(zhǔn)確率，本課題首次嘗試使用流式細(xì)胞分選法并結(jié)合雙滅活兩種方法取得了良好的效果。經(jīng)過(guò)對(duì)融合子再生及發(fā)酵培養(yǎng)，篩選獲得菌株YR-2，其油脂含量達(dá)43.18％，24C含量為3.26％，ARA產(chǎn)量達(dá)6.32 g/L，并具有良好的遺傳穩(wěn)定性，達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。本研究為高山被孢霉菌種選

5、育提供了新思路，可促進(jìn)ARA生產(chǎn)的產(chǎn)能升級(jí)與產(chǎn)品品質(zhì)提升。
　　一直以來(lái)，M.alpina研究及發(fā)酵生產(chǎn)所用氮源原料均為天然培養(yǎng)基（含酵母粉），其成分復(fù)雜、不同批次易存在較大差異，不利于精細(xì)實(shí)驗(yàn)分析以及工業(yè)生產(chǎn)的穩(wěn)定。因此，使用無(wú)機(jī)氮源對(duì)其進(jìn)行替換實(shí)現(xiàn)全合成培養(yǎng)基發(fā)酵具有現(xiàn)實(shí)意義。本課題通過(guò)分類(lèi)及單因素缺失實(shí)驗(yàn)確定了氨基酸混合物、無(wú)機(jī)鹽以及生長(zhǎng)因子的添加量，初步確定了M.alpina全合成培養(yǎng)基成分。雖目前獲得的ARA產(chǎn)量為天然培