真鯛血漿中卵黃蛋白原的柱后熒光衍生檢測(cè)及其在環(huán)境雌激素生物標(biāo)志物中的應(yīng)用.pdf

1、卵黃蛋白原(Vtg)通常只存在于性成熟的雌魚里,但是當(dāng)雄魚或幼魚暴露于環(huán)境雌激素時(shí),其體內(nèi)也能產(chǎn)生Vtg。因此,Vtg被認(rèn)為是一種理想的環(huán)境雌激素的生物標(biāo)志物。Vtg的檢測(cè)方法主要是特異性的免疫分析方法,方法靈敏,選擇性強(qiáng)；但耗時(shí)長(zhǎng),操作繁瑣。因此,建立快速、簡(jiǎn)便、可靠的Vtg檢測(cè)方法是深入開展Vtg作為環(huán)境雌激素標(biāo)志物研究的關(guān)鍵前提。目前對(duì)Vtg的研究主要集中在淡水魚類,對(duì)海水魚類的研究較少。隨著環(huán)境污染的加劇,大量污染物被排入大海,

2、使沿海污染日益嚴(yán)重,因此有必要開展海洋魚類Vtg的研究,用于監(jiān)測(cè)海洋環(huán)境雌激素的污染。本論文選擇海魚真鯛為研究動(dòng)物,從血漿中純化獲得Vtg的標(biāo)樣；建立了非特異性測(cè)定Vtg的分析新方法；并在新方法的基礎(chǔ)上,開展真鯛血漿中Vtg作為環(huán)境雌激素標(biāo)志物的研究。本研究的主要內(nèi)容和結(jié)果包括以下幾個(gè)方面：1.真鯛Vtg的誘導(dǎo)、純化及初步鑒定采用17β-雌二醇(E2)腹腔注射,使真鯛在7 d內(nèi)產(chǎn)生大量Vtg；利用陰離子交換(DEAE Sepharose

3、 Fast Flow樹脂)低壓液相色譜系統(tǒng),一步純化Vtg。從色譜圖和電泳譜圖可知,該蛋白只存在于E2誘導(dǎo)后的真鯛血漿中和雌魚對(duì)照血漿中,而不存在于雄魚對(duì)照血漿中,說(shuō)明該蛋白是雌性特異性蛋白,能夠被E2誘導(dǎo)產(chǎn)生。該蛋白經(jīng)Native-PAGE電泳,結(jié)果表明真鯛有兩種形式的Vtg,分子量分別為570 kDa和360 kDa；該蛋白經(jīng)SDS-PAGE后,可形成分子量為180 kDa、115 kDa和70 kDa的3條蛋白帶。磷、脂、糖蛋白分

4、析證實(shí),所獲取的Vtg是一類含磷、含脂、含糖的大分子蛋白。對(duì)真鯛腹腔注射4-壬基酚,發(fā)現(xiàn)4-壬基酚也能誘導(dǎo)真鯛體內(nèi)Vtg的產(chǎn)生。2.柱后熒光衍生-高效液相色譜法測(cè)定魚血漿中的Vtg利用高效陰離子交換Mini Q柱分離和柱后鄰苯二甲醛(OPA)熒光衍生,建立了快速測(cè)定血漿中Vtg的方法。對(duì)柱后衍生反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,最終確定衍生反應(yīng)的條件為：衍生液pH值為10.5；衍生液中硼砂濃度為40 mmol/L；OPA濃度為0.4 mg/mL；反應(yīng)