重金屬污染農(nóng)田土壤中抗生素抗性基因與可移動(dòng)遺傳元件的分布.pdf

1、目的:描述某重金屬污染農(nóng)田土壤中抗生素抗性基因（ARGs）以及參與ARGs水平轉(zhuǎn)移（HGT）的可移動(dòng)遺傳元件（MGE）陽(yáng)性率及相對(duì)豐度的時(shí)間、空間分布規(guī)律。在此基礎(chǔ)上嘗試分析重金屬含量與 ARGs、MGEs相對(duì)豐度之間的相關(guān)性。
　　方法:
　　1.按照《土壤環(huán)境監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》（HJ/ T166-2004），分別于2014年3月、6月、10月和2015年1月在河南省某重金屬污染農(nóng)田土壤中常年主導(dǎo)風(fēng)向的下風(fēng)向采集4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的農(nóng)

2、田土壤混合樣。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采樣根據(jù)距離工廠(chǎng)煙囪的位置由近及遠(yuǎn)選擇7塊農(nóng)田土壤，距離分別約為741m、943m、1514m、1617m、1777m、2103m和2556m，分別編號(hào)為G1-G7號(hào)采樣區(qū)。
　　2.土壤脫腐預(yù)處理后試劑盒提取土壤總 DNA。普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè) ARGs和MGEs共計(jì)19種。其中4種MGEs包括：inti1、inti2、orf513和ISCR2，15種ARGs包括：sul1、sul2、tetA

3、、tetC、tetE、tetM、tetQ、tetW、CTX-M-1、bla-TEM、SHV、strA、qnrA、qnrB和qnrS。
　　3.實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)(qPCR)對(duì)目的基因inti1、sul1、sul2、tetA、tetM、tetW定量檢測(cè)。
　　4.使用SPSS21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。Fisher精確概率法分析不同時(shí)間點(diǎn)不同距離土樣上 ARGs與 MGEs陽(yáng)性率的差異。Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)

4、基因相對(duì)豐度所有數(shù)據(jù)的正態(tài)性，Kruskal-Wallis H多組秩和檢驗(yàn)、兩相關(guān)樣本非參數(shù)檢驗(yàn)、Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)分析不同時(shí)間點(diǎn)不同距離采樣區(qū)上 ARGs與 MGEs相對(duì)豐度的差異。Spearman相關(guān)性分析了解各基因間、基因與重金屬之間的相關(guān)關(guān)系。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果:
　　1.普通PCR共檢測(cè)出8種ARGs、3種MGEs。8種ARGs的陽(yáng)性率分別是sul2（22/28，78.6％）、tetC（22

5、/28，78.6%）、bla-TEM（18/28，64.3%）、sul1（15/28，53.6%）、tetA（11/28，39.3%）、strA（9/28，32.2%）、tetM（6/28，21.4%）和tetW（3/28，10.7%）。3種 MGEs的陽(yáng)性率分別是 inti1（18/28，64.3%）、inti2（3/28，10.7%）和ISCR2（7/28，25.0%）。測(cè)序序列上傳GenBank，序列號(hào)分別為：KT625466，K

6、T625467，KT625472，KT625465，KU940035，KU940037，KT625468，KT625470，KT625469，KU940036，KT625471。
　　2.每個(gè)采樣區(qū)上4個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)間總基因陽(yáng)性率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但在3月不同距離土樣間總基因陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；單個(gè)基因不同距離采樣區(qū)的陽(yáng)性率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；抗生素抗性基因 sul2、tetC、bla-TEM和可移動(dòng)遺傳元件 inti14個(gè)時(shí)

7、間點(diǎn)間陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同一采樣時(shí)間點(diǎn)上各基因間的陽(yáng)性率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；G2、G6采樣區(qū)上各基因間的陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.3月、6月不同距離土樣中總基因相對(duì)豐度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；G3、G4、G5采樣區(qū)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)間總基因相對(duì)豐度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；單個(gè)基因在不同距離土樣上相對(duì)豐度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；可移動(dòng)遺傳元件 inti1在4個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)間的相對(duì)豐度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；G2采樣區(qū)不同基因間相對(duì)豐度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

8、；10月、1月單個(gè)基因間的相對(duì)豐度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4. inti1與總基因相對(duì)豐度之間存在正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.644，總sul與總tet相對(duì)豐度相關(guān)系數(shù)為0.743，sul1與 tetM、tetA、tetW相對(duì)豐度存在相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.711，0.519，0.535，sul2與 tetM、tetA相對(duì)豐度相關(guān)系數(shù)分別為0.480，0.411；tetM與 tetW相對(duì)豐度之間相關(guān)系數(shù)為0.742，sul1與 sul2

9、相對(duì)豐度相關(guān)系數(shù)為0.386。所有相關(guān)均有P<0.05。
　　5. sul1相對(duì)豐度與重金屬砷、鎘、鋅、銅含量之間的相關(guān)系數(shù)在0.162~0.516之間，四環(huán)素類(lèi)抗性基因 tetW相對(duì)豐度與銅含量相關(guān)系數(shù)為0.375，基因總豐度與As含量顯著相關(guān)系數(shù)為0.375。所有相關(guān)均P<0.05。
　　結(jié)論:
　　1.該工廠(chǎng)附近農(nóng)田土壤中可見(jiàn)一定類(lèi)型的ARGs及MGEs分布（常見(jiàn)sul2、tetC、bla-TEM和inti1），