養(yǎng)殖底泥和農(nóng)用土壤抗生素抗性組學(xué)研究.pdf

1、抗生素抗性問(wèn)題已成為當(dāng)前國(guó)際上的研究熱點(diǎn)之一。抗生素的長(zhǎng)期濫用使動(dòng)物和人體內(nèi)形成大量的抗性菌株，經(jīng)排泄后抗性菌株攜帶的抗性基因也隨之進(jìn)入環(huán)境；另一方面，水產(chǎn)、養(yǎng)殖、醫(yī)療等行業(yè)使用的抗生素經(jīng)排放后使得環(huán)境中抗生素濃度升高，也導(dǎo)致環(huán)境抗生素抗性基因數(shù)量增加，種類變多?？股乜剐曰蚓哂泻芨叩倪w移性和活性，可以通過(guò)基因的水平轉(zhuǎn)移在環(huán)境中傳播，是一類新型的環(huán)境污染物。
　　為了研究環(huán)境中的抗性基因，采集清水灌溉、污水灌溉的水稻土和養(yǎng)蝦池底

2、泥，分別提取上述三個(gè)環(huán)境樣品的總DNA，構(gòu)建宏基因組文庫(kù)。獲得的克隆子用14種抗生素進(jìn)行抗性篩選，將表達(dá)抗性的克隆子進(jìn)行測(cè)序，所得序列首先用NCBI中的ORF Finder軟件查找開(kāi)放閱讀框，之后通過(guò)BLAST和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析可能的抗性基因。
　　通過(guò)抗生素抗性篩選，得到28個(gè)抗性克隆子：其中11個(gè)表達(dá)對(duì)二甲胺四環(huán)素（Min）的抗性，8個(gè)表達(dá)對(duì)四環(huán)素（Tet）的抗性，4個(gè)表達(dá)對(duì)卡那霉素（Kan）的抗性，2個(gè)表達(dá)對(duì)利福平（Rif）的

3、抗性，各有1個(gè)表達(dá)對(duì)土霉素（Oxy）、鏈霉素（Str）、氯霉素（Chl）的抗性。
　　對(duì)抗性克隆子插入序列進(jìn)行分析的結(jié)果表明：不同類抗生素的抗性機(jī)制和抗性基因各不相同：
　?。?）細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類藥物的抗性多與修飾酶的產(chǎn)生有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)篩選到5個(gè)氨基糖苷類抗生素抗性基因，其中，4個(gè)基因的產(chǎn)物與氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶以及氨基糖苷核苷轉(zhuǎn)移酶最相似，另有1個(gè)基因的產(chǎn)物與外排蛋白最相似。
　　（2）篩選到的四環(huán)素

4、類抗生素抗性基因與已報(bào)道的的抗性基因在氨基酸水平上的相似性極低，其中，5個(gè)基因編碼的產(chǎn)物與外排蛋白最相似，4個(gè)基因編碼的產(chǎn)物與修飾酶最相似，5個(gè)基因的產(chǎn)物與DNA合成、轉(zhuǎn)錄或翻譯相關(guān)的蛋白最相似，6個(gè)克隆子包含的ORFs的產(chǎn)物與未知功能的蛋白最相似。編碼四環(huán)素修飾酶的抗性基因在之前的報(bào)道中并不多見(jiàn)，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明目前的研究可能低估了此種抗性基因的存在。
　?。?）篩選到1個(gè)Chl抗性基因，其編碼的產(chǎn)物與主動(dòng)外排系統(tǒng)TonB最相似

5、，相似性僅為43％。氯霉素抗性常見(jiàn)的機(jī)制為產(chǎn)生乙?；D(zhuǎn)移酶，本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)編碼乙?；D(zhuǎn)移酶的基因可能是由于受到異源表達(dá)的限制。
　?。?）篩選到2個(gè)Rif抗性基因，其編碼的產(chǎn)物與ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器相關(guān)蛋白最相似。
　　本實(shí)驗(yàn)篩選到的抗性基因，其編碼的產(chǎn)物多數(shù)與已知氨基酸序列相似性較低，約有60%的抗性基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與已知氨基酸序列的最大相似性小于65%，為新的抗性基因。一方面說(shuō)明環(huán)境是抗性基因巨大的儲(chǔ)庫(kù)，