養(yǎng)殖底泥和農(nóng)用土壤抗生素抗性組學(xué)研究.pdf

1、抗生素抗性問題已成為當(dāng)前國際上的研究熱點(diǎn)之一?？股氐拈L期濫用使動物和人體內(nèi)形成大量的抗性菌株，經(jīng)排泄后抗性菌株攜帶的抗性基因也隨之進(jìn)入環(huán)境；另一方面，水產(chǎn)、養(yǎng)殖、醫(yī)療等行業(yè)使用的抗生素經(jīng)排放后使得環(huán)境中抗生素濃度升高，也導(dǎo)致環(huán)境抗生素抗性基因數(shù)量增加，種類變多。抗生素抗性基因具有很高的遷移性和活性，可以通過基因的水平轉(zhuǎn)移在環(huán)境中傳播，是一類新型的環(huán)境污染物。
　　為了研究環(huán)境中的抗性基因，采集清水灌溉、污水灌溉的水稻土和養(yǎng)蝦池底

2、泥，分別提取上述三個環(huán)境樣品的總DNA，構(gòu)建宏基因組文庫。獲得的克隆子用14種抗生素進(jìn)行抗性篩選，將表達(dá)抗性的克隆子進(jìn)行測序，所得序列首先用NCBI中的ORF Finder軟件查找開放閱讀框，之后通過BLAST和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析可能的抗性基因。
　　通過抗生素抗性篩選，得到28個抗性克隆子：其中11個表達(dá)對二甲胺四環(huán)素（Min）的抗性，8個表達(dá)對四環(huán)素（Tet）的抗性，4個表達(dá)對卡那霉素（Kan）的抗性，2個表達(dá)對利福平（Rif）的

3、抗性，各有1個表達(dá)對土霉素（Oxy）、鏈霉素（Str）、氯霉素（Chl）的抗性。
　　對抗性克隆子插入序列進(jìn)行分析的結(jié)果表明：不同類抗生素的抗性機(jī)制和抗性基因各不相同：
　　（1）細(xì)菌對氨基糖苷類藥物的抗性多與修飾酶的產(chǎn)生有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)篩選到5個氨基糖苷類抗生素抗性基因，其中，4個基因的產(chǎn)物與氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶以及氨基糖苷核苷轉(zhuǎn)移酶最相似，另有1個基因的產(chǎn)物與外排蛋白最相似。
　?。?）篩選到的四環(huán)素

4、類抗生素抗性基因與已報道的的抗性基因在氨基酸水平上的相似性極低，其中，5個基因編碼的產(chǎn)物與外排蛋白最相似，4個基因編碼的產(chǎn)物與修飾酶最相似，5個基因的產(chǎn)物與DNA合成、轉(zhuǎn)錄或翻譯相關(guān)的蛋白最相似，6個克隆子包含的ORFs的產(chǎn)物與未知功能的蛋白最相似。編碼四環(huán)素修飾酶的抗性基因在之前的報道中并不多見，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明目前的研究可能低估了此種抗性基因的存在。
　?。?）篩選到1個Chl抗性基因，其編碼的產(chǎn)物與主動外排系統(tǒng)TonB最相似

5、，相似性僅為43％。氯霉素抗性常見的機(jī)制為產(chǎn)生乙?；D(zhuǎn)移酶，本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)編碼乙?；D(zhuǎn)移酶的基因可能是由于受到異源表達(dá)的限制。
　　（4）篩選到2個Rif抗性基因，其編碼的產(chǎn)物與ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器相關(guān)蛋白最相似。
　　本實(shí)驗(yàn)篩選到的抗性基因，其編碼的產(chǎn)物多數(shù)與已知氨基酸序列相似性較低，約有60%的抗性基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與已知氨基酸序列的最大相似性小于65%，為新的抗性基因。一方面說明環(huán)境是抗性基因巨大的儲庫，