中國(guó)沿海典型養(yǎng)殖水域抗生素及其抗性基因污染的初步研究.pdf

1、我國(guó)擁有遼闊的海洋面積，沿海灘涂分布十分廣泛，是全球最大的海水養(yǎng)殖大國(guó)。近年來(lái)，隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖業(yè)已經(jīng)給環(huán)境造成了巨大的壓力，產(chǎn)生了一系列的環(huán)境問(wèn)題。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，抗生素是防治病害的主要藥物，但長(zhǎng)期重復(fù)使用一種抗生素不僅會(huì)降低抗生素的藥效，還有可能誘導(dǎo)動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗生素抗性基因（ARGs），從而無(wú)法有效治療致病菌引發(fā)的疾病。ARGs可以在土壤、水體、地下水等各種環(huán)境介質(zhì)中遷移、轉(zhuǎn)化，最終通過(guò)食物鏈進(jìn)入動(dòng)物及人體，一旦

2、人類致病菌獲得此類ARGs，將有可能威脅到人類的健康?？股丶癆RGs污染已經(jīng)成為一個(gè)全球性的環(huán)境問(wèn)題，由此而產(chǎn)生的潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)也日益引起各國(guó)政府和研究者的廣泛關(guān)注。在我國(guó)，由于抗生素的使用沒(méi)有得到良好的監(jiān)督，在沿海的沉積物檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)抗生素的殘留濃度過(guò)高，從而導(dǎo)致抗生素抗性基因（ARGs）的出現(xiàn)、傳播和聚集。由此可見(jiàn)，在中國(guó)的海水養(yǎng)殖環(huán)境中，抗生素耐藥性的存在情況非常嚴(yán)重，所以在中國(guó)沿海的集約化養(yǎng)殖區(qū)域開(kāi)展抗生素耐藥性的檢測(cè)是非常必要

3、的。
　　本實(shí)驗(yàn)中，選取我國(guó)沿海11個(gè)典型養(yǎng)殖水域進(jìn)行底泥樣品的采集，采樣地點(diǎn)主要包括大連，唐山，蓬萊，連云港，啟東，象山，寧德，東山，湛江，漣水，美濟(jì)礁。首先，經(jīng)過(guò)查閱資料最終確定選擇兩種磺胺類（磺胺嘧啶和磺胺甲惡唑）、兩種四環(huán)素類（四環(huán)素和土霉素）和兩種喹諾酮類（環(huán)丙沙星和恩諾沙星）作為研究對(duì)象，通過(guò)固相萃?。⊿PE）和 HPLC-MS/MS（高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜）對(duì)每個(gè)采樣地點(diǎn)的底泥樣品中的抗生素進(jìn)行定量分析。然后，對(duì)采集

4、樣品進(jìn)行高通量測(cè)序，利用Qiime軟件、mothur軟件等對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，之后對(duì)樣品中細(xì)菌群落進(jìn)行豐度分析、Alpha分析和群落結(jié)構(gòu)分析。接著，分離篩選單菌落，將一部分的混合進(jìn)行高通量測(cè)序，數(shù)據(jù)處理之后對(duì)各采樣點(diǎn)抗生素抗性細(xì)菌進(jìn)行豐度分析、Alpha分析和群落結(jié)構(gòu)分析；另一部分進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，結(jié)合提取總DNA并進(jìn)行了熒光定量PCR技術(shù)和高通量測(cè)序的樣品進(jìn)行比較，通過(guò)mothur軟件和R軟件等對(duì)各采樣點(diǎn)的抗生素抗性基因進(jìn)行定

5、量分析和ARGs種類的檢出率及豐度分析。最后通過(guò)比較不同養(yǎng)殖區(qū)域底泥的抗生素污染情況、底泥中細(xì)菌群落的多樣性以及比較不同養(yǎng)殖區(qū)域底泥在不同的抗生素作用下，抗生素抗性細(xì)菌及其抗性基因的多樣性特征變化，掌握當(dāng)前我國(guó)沿海養(yǎng)殖密集水域抗生素及其抗性基因的污染狀況，為后續(xù)我國(guó)沿海水產(chǎn)養(yǎng)殖的相關(guān)研究提供參考依據(jù)。
　　本研究發(fā)現(xiàn)：（1）每個(gè)實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)都存在著抗生素污染的情況，其中四環(huán)素類和磺胺類抗生素的污染情況比喹諾酮類抗生素的污染情況嚴(yán)重。數(shù)

6、據(jù)顯示鹽酸四環(huán)素在PL（蓬萊）地區(qū)的最高濃度為1230.49μg/kg，磺胺嘧啶在PL（蓬萊）地區(qū)的濃度為714.56μg/kg，磺胺甲惡唑在TS（唐山）地區(qū)的濃度395.25μg/kg；（2）不同養(yǎng)殖區(qū)域，細(xì)菌群落的豐富度存在著一定的差異，但厚壁菌門和變形菌門是我國(guó)東部沿海典型養(yǎng)殖水域底泥中主要的細(xì)菌門類，其中芽孢桿菌在所有的細(xì)菌類群中占有明顯的優(yōu)勢(shì)；（3）在大部分養(yǎng)殖水域，抗四環(huán)素類和磺胺類細(xì)菌群落中，厚壁菌占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；抗喹諾酮類

7、細(xì)菌群落中，變形菌占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。此外，美濟(jì)礁地區(qū)的抗生素抗性細(xì)菌的多樣性是所有檢測(cè)點(diǎn)中最低的；（4）抗生素抗性基因（ARGs）在我國(guó)沿海典型養(yǎng)殖水域中普遍存在，其中 PL中的sul1和 sul2（sul1/16S rDNA的結(jié)果是6.87×10-2，sul2/16S rDNA的結(jié)果是8.99×10-2）是最高的。tetB基因豐度水平最高（1.57×10-2）出現(xiàn)在TS地區(qū)。另外，baca占所有ARGs的比例都很大；其中以 DL最高（87