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文檔簡介
1、近年來,基于元素標記策略的電感耦合等離子體質譜(ICPMS)定量生物分析已經(jīng)越來越引起學術界關注。由于生物分子中天然存在的非/類金屬元素(如S,P,Se)和金屬元素(如Fe,Mn,Co,Ni,Zn等)或者存在著元素離子化效率較低,或者有多原子干擾,或者是基于配位作用而導致元素結合不穩(wěn)定等缺欠,引入外源的金屬元素,特別是鑭系元素及其同位素,來實現(xiàn)生物分子的元素標記和ICPMS定量分析逐漸成為了主流趨勢,并展現(xiàn)出了廣闊的應用前景?;阼|系元
2、素標記策略的ICPMS生物分子定量分析方法,具有靈敏度高、線性范圍寬、樣品基質干擾小等優(yōu)點,特別是同位素稀釋方法的運用,使得生物分子絕對定量結果更加的準確和可信。目前而言,基于元素標記的生物分子定量分析策略已經(jīng)從傳統(tǒng)的in vitro分析方法學研究(例如,核酸和模型蛋白質標記)向實際生物體系中的in vivo生物分子靶向標記轉變,從而為關鍵生物學問題的解決提供更多的客觀情報和研究思路。然而,基于元素標記策略的ICPMS生物定量分析的一個
3、關鍵科學問題就是如何特異性的將金屬元素標記到生物分子上去,這種元素標記策略必須具有生物特異性好,反應動力學迅速,特別是標記策略生物兼容性要好,而且具有明確的元素標記化學計量比等基本條件,這就使得發(fā)展生物分子特異性元素標記策略成為了大家越來越感興趣,同時也極具挑戰(zhàn)性的研究課題。從分析方法的選擇性和靈敏度兩大核心問題出發(fā),我們在本論文中針對如何特異性地實現(xiàn)生物分子元素標記并且運用到實際生物體系這一具有挑戰(zhàn)性的科學問題進行了研究。我們以點擊反
4、應為橋梁,從基于蛋白酶生物活性和生物代謝的標記策略出發(fā),實現(xiàn)生物分子的特異性/專一性鑭系元素標記,解決目標生物分子標記選擇性和ICPMS檢測靈敏度的問題,并將這種標記策略擴展到實際的生物學體系,探索和嘗試了一些生物學熱點問題的研究。
本研究分為六個部分:第一章介紹并且梳理近年來基于元素標記策略的生物分子定量分析方法,并且簡要分析和探討其中存在的問題。另外,針對近年來在化學生物學研究領域興起的生物正交反應及其在化學和生物學研究中
5、的應用做了基本的介紹和闡述。第二章以銅催化的點擊化學反應為橋梁,基于酶生物催化活性的元素特異性標記策略,實現(xiàn)細胞色素氧化還原酶P4503A4亞型(CYP3A4)的特異性元素銪(Eu)的標記,并利用153Eu-形態(tài)非特異性同位素稀釋ICPMS對其進行了絕對定量分析;與CYP3A4的生物活性關聯(lián)起來,使得我們不僅可以測得CYP3A4的絕對含量,而且能夠從ICPMS測得的結果對其酶催化活性進行評價。第三章瞄準活細胞內(nèi)的谷胱甘肽巰基轉移酶Ome
6、ga1(GSTO1),利用無銅催化點擊反應和酶生物活性的特異性標記策略,實現(xiàn)了細胞內(nèi)GSTO1的熒光成像和定量分析;利用同位素稀釋ICPMS定量方法研究了抗腫瘤藥物順鉑對細胞內(nèi)GSTO1表達含量的影響。和熒光成像方法相比,尺寸排阻色譜分離(SEC)與同位素稀釋ICPMS定量方法相結合能夠克服細胞內(nèi)游離小分子和多余元素標簽的干擾,得到了準確的GSTO1的定量信息。第四章以細菌為研究對象,利用炔基修飾的D-丙氨酸(D-Ala)可以代謝組裝細
7、菌細胞壁肽聚糖結構中,結合銅催化的點擊反應實現(xiàn)了細菌細胞壁肽聚糖結構中D-Ala的專一性有機染料和Eu元素標記,實現(xiàn)了其成像和定量分析。通過同位素稀釋的方法得到了細菌細胞壁肽聚糖結構中D-Ala的準確含量,結合細菌數(shù)目計數(shù),我們得到了細菌表面D-Ala密度這一參數(shù)(dDA),dDA使我們能夠進一步考察細菌細胞壁肽聚糖中D-Ala的調節(jié)功能,也為利用ICPMS進行細菌計數(shù)分析提供了一條有效途徑。另外,我們著重考察了在抗生素作用下細菌細胞壁
8、肽聚糖中D-Ala的含量變化,并對相應的抗生素殺菌機理和耐藥性機制做了初步探索和討論,深化了我們對抗生素以及細菌細胞壁結構本身的認識,為將來設計和評價針對細菌細胞壁的新抗生素藥物進行了理論和技術儲備。第五章面向細胞表面的關鍵糖苷分子-唾液酸糖苷,假以生物特異性代謝機制并結合無銅催化生物正交反應,實現(xiàn)了細胞表面唾液酸的成像和定量分析。在所建立的軟性多維分析平臺上可以進行熒光分子和元素標簽分別標記,實現(xiàn)了細胞表面唾液酸的熒光成像和ICPMS
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