電化學(xué)傳感器在黃曲霉產(chǎn)毒機(jī)制研究中的應(yīng)用.pdf

1、黃曲霉毒素是黃曲霉菌等絲狀真菌在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物。極少量的黃曲霉毒素即可對(duì)人體健康產(chǎn)生很大的危害，其生成對(duì)糧食和農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)也具有很大的影響。因此，有效控制黃曲霉菌生長(zhǎng)，尤其是抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生，對(duì)于保障農(nóng)業(yè)和糧食安全意義重大。近年來(lái)，科學(xué)工作者開(kāi)展了大量工作，研究黃曲霉菌的產(chǎn)毒機(jī)制，為有效抑制毒素生成提供了理論指導(dǎo)?；钚匝酰≧eactive oxygen species，ROS）是生物體有氧代謝的產(chǎn)物，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、維持

2、機(jī)體氧化-還原平衡等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，ROS與黃曲霉毒素的胞內(nèi)合成過(guò)程密切相關(guān)，菌絲細(xì)胞內(nèi)ROS的水平可能是黃曲霉毒素合成的重要前提條件。因此，檢測(cè)ROS及其相關(guān)酶類(lèi)，對(duì)于理解黃曲霉產(chǎn)毒過(guò)程，并進(jìn)一步研究毒素合成抑制機(jī)制顯得尤為關(guān)鍵。傳統(tǒng)的分子生物學(xué)方法（如基因敲除法等）雖能建立基因和功能之間的關(guān)系，但不能實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)、快速、靈敏檢測(cè)，不利于理解生命過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)。電化學(xué)傳感器專(zhuān)一性強(qiáng)、靈敏度高，可以實(shí)時(shí)、快速的檢測(cè)生物靶分

3、子，如能將其用于黃曲霉產(chǎn)毒機(jī)制的研究，將有可能在不影響黃曲霉菌活性的前提下，提供更多原位、實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)。在本論文中，我們開(kāi)發(fā)了多種基于納米材料的電化學(xué)傳感器，并將它們用于黃曲霉菌過(guò)氧化氫酶、超氧陰離子和過(guò)氧化氫的檢測(cè)，對(duì)黃曲霉產(chǎn)毒機(jī)制以及抗菌物質(zhì)的抑產(chǎn)毒機(jī)制進(jìn)行了分析。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴采用電沉積方法構(gòu)建石墨烯-納米金（AuNPs）電化學(xué)傳感器，并通過(guò)場(chǎng)發(fā)射電子顯微鏡（FESEM）、拉曼（Raman）光譜和X衍射儀證實(shí)傳感器

4、構(gòu)建成功。通過(guò)外加H2O2，并測(cè)定其濃度可以判斷過(guò)氧化氫酶（CAT）活性，通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，得到該傳感器對(duì)H2O2檢測(cè)線性范圍為2-30μM，檢測(cè)下限為0.2μM，對(duì)CAT活性的檢測(cè)范圍是0-48 U/mg prot。將該傳感器用于黃曲霉菌粗提液CAT活性檢測(cè)，結(jié)果顯示，隨著菌絲培養(yǎng)時(shí)間的逐漸延長(zhǎng)，霉菌粗提液中的CAT活性隨之增強(qiáng)，且黃曲霉毒素的含量也在增加。霉菌粗提液中的CAT活性與菌液中黃曲霉毒素的含量呈正相關(guān)。該結(jié)果表明，霉

5、菌粗提液中的CAT活性可用作黃曲霉產(chǎn)毒的生物標(biāo)志。其機(jī)制推測(cè)為：當(dāng)黃曲霉生長(zhǎng)迅速時(shí)，菌絲代謝旺盛，隨之產(chǎn)生的有氧代謝產(chǎn)物 ROS也進(jìn)一步增多，為了實(shí)現(xiàn)生物氧化還原平衡，CAT活性也相應(yīng)增強(qiáng)，而 ROS的增加將促進(jìn)黃曲霉毒素合成，因此，CAT活性與毒素合成之間呈正相關(guān)。⑵采用化學(xué)還原方法合成霉菌產(chǎn)毒抑制劑----納米銀（AgNPs），并通過(guò)透射電子顯微鏡（TEM）、紫外分光光度計(jì)（UV-VIS）等進(jìn)行表征，證實(shí)其為球狀結(jié)構(gòu)，尺度為4.5

6、nm，可用于后續(xù)抑菌實(shí)驗(yàn)。納米銀處理可顯著降低黃曲霉菌毒素的產(chǎn)量。水熱法合成人工納米酶Mn3O4納米棒，將其與多壁碳納米管（MWCNTs）復(fù)合，構(gòu)建MWCNTs-Mn3O4納米棒超氧陰離子（O2-）電化學(xué)傳感器。通過(guò)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，該傳感器檢測(cè)的線性范圍為57.5-862.5 nM，檢測(cè)下限為57.5 nM。將制備的傳感器用于黃曲霉胞外釋放的O2-實(shí)時(shí)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)AgNPs的加入可刺激黃曲霉菌瞬時(shí)釋放大量O2-分子。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)

7、AgNPs抑制毒素產(chǎn)生的可能機(jī)制為：AgNPs刺激黃曲霉后，O2-分子立即從菌絲體分泌，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平迅速降低，細(xì)胞內(nèi)氧化水平的降低進(jìn)一步影響黃曲霉毒素生物合成的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，最終導(dǎo)致黃曲霉毒素含量的降低。⑶生物質(zhì)已被廣泛用作碳源來(lái)制備不同結(jié)構(gòu)的碳材料，黃曲霉分生孢子具有微米尺度的球狀結(jié)構(gòu)，有可能作為原材料制備空心結(jié)構(gòu)微米碳球。在本研究中，通過(guò)對(duì)黃曲霉孢子碳化制備得到中空碳微球。然后，在碳微球表面原位生長(zhǎng)AuNPs，將該復(fù)合材