纖維堆囊菌優(yōu)選菌株Soce157-2限制性遺傳屏障的研究.pdf

1、粘細(xì)菌按照其利用底物類型的差異，分為嗜細(xì)菌群和嗜纖維素群兩大類，在嗜纖維素群中，纖維堆囊菌屬是目前唯一可以分解纖維素的菌屬。目前，纖維堆囊菌通過優(yōu)化發(fā)酵技術(shù)的途徑提高埃博霉素產(chǎn)量的研究已達(dá)到瓶頸，因此，利用合成分子機(jī)制提高次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量是目前纖維堆囊菌研究的重點(diǎn)，而建立高效的遺傳操作體系是纖維堆囊菌研究的基礎(chǔ)。此外，在粘細(xì)菌類群中，同一種屬的不同菌株之間，其遺傳操作同樣也難以通用。本文應(yīng)用的纖維堆囊菌 Soce157-2，在菌體中尚未

2、發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性質(zhì)粒，因此，應(yīng)用于纖維堆囊菌遺傳操作的載體，需借助外源質(zhì)粒來實(shí)現(xiàn)，其操作難度大且效率較低，而且纖維堆囊菌對(duì)大部分的抗生素都有抗性，所以，遺傳標(biāo)記的篩選范圍較窄，限制了其分子水平研究的進(jìn)展。上述基本狀況是纖維堆囊菌遺傳操作困難原因的一方面，另一方面是由于限制修飾系統(tǒng)的存在，明顯阻礙或減少了外源DNA的進(jìn)入。外源DNA由于沒有被修飾過，一旦進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)就會(huì)被降解，很大程度上影響了該菌遺傳操作的成功率。
　　基于上述分析，本文將

3、在以下方面進(jìn)行研究：
　　1.對(duì)實(shí)驗(yàn)室所用菌株纖維堆囊菌So ce157-2進(jìn)行了系統(tǒng)的生理生化反應(yīng)和32種抗生素抗性的分析，為纖維堆囊菌的遺傳操作和限制修飾系統(tǒng)的探究提供了可靠的生理生化基礎(chǔ)，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析和對(duì)前人實(shí)驗(yàn)的綜合考慮，選用了氯霉素作為篩選標(biāo)記。由于纖維堆囊菌不同于其他細(xì)菌，代時(shí)長(zhǎng)，生長(zhǎng)緩慢，極易染菌，因此，本文通過一系列單因素和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)纖維堆囊菌So ce157-2生長(zhǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到最佳實(shí)驗(yàn)條件為：裝液量

4、60 mL/250 mL，在溫度32℃、初始pH9.0、接種量6％、生長(zhǎng)時(shí)間72 h、種齡60 h條件下，纖維堆囊菌So ce157-2培養(yǎng)活性最佳。
　　2.纖維堆囊菌的G+C含量高，載體自身的啟動(dòng)子元件由于G+C含量低于So ce157-2的G+C含量，無法正常表達(dá)氯霉素抗性，因此選用aphII作為啟動(dòng)子。經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得aphII啟動(dòng)子片段和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因片段，將其連接后導(dǎo)入自殺質(zhì)粒 pCVD442中，構(gòu)建 pCVD4

5、42-cat載體，將從 So ce157-2的基因組中PCR得到的三段不同大小的片段分別導(dǎo)入pCVD442-cat載體中，獲得pCVD442-cat-1、pCVD442-cat-2、pCVD442-cat-3三種質(zhì)粒，通過接合轉(zhuǎn)移的方法從雙質(zhì)粒大腸桿菌中轉(zhuǎn)移至So157-2中，陽性率達(dá)到了100%，建立了遺傳操作系統(tǒng)。通過pH值及熱擊對(duì)接合轉(zhuǎn)移效率影響的摸索，確定pH值為8.5至9.0時(shí)，接合轉(zhuǎn)移效率最高，較之前提高了15~18倍，但熱