魚腥草揮發(fā)油抗淋巴瘤藥效學(xué)及其固體脂質(zhì)納米粒的制備研究.pdf

1、淋巴瘤是一種血液系統(tǒng)性惡性腫瘤，其中非霍奇金淋巴瘤（ non-Hodgkin lymphoma，NHL）約占90％[1-3]。NHL分為B細(xì)胞和T細(xì)胞兩種類型，其中B細(xì)胞型NHL發(fā)病率在80%以上。B細(xì)胞型NHL中最為常見的是彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤( diffuse large B-celllymphoma，DLBCL)，DLBCL屬侵襲性淋巴瘤，迫切需要臨床治療上的突破[4-5]。
　　魚腥草(Houttuynia cordata

2、 Thunb.)屬三白草科植物，其味辛，性微寒，主要用于治療肺癰吐膿、熱痢熱淋、痛腫瘡毒等證狀。魚腥草主要成分為揮發(fā)油部分[6]。魚腥草揮發(fā)油（volatile oil from Houttuynia cordata Thunb Herba, HHO）對肺炎、慢性宮頸炎等均有較好的療效，對急性結(jié)膜炎也有一定療效[7-8]。因此，有關(guān)HHO藥理作用的研究成為了熱點。
　　前期實驗表明，HHO能顯著抑制彌漫大 B細(xì)胞淋巴瘤SUDHL-

3、4細(xì)胞生長增殖。故本文從 HHO的體外抗非霍奇金淋巴瘤作用，體內(nèi)藥效學(xué)研究以及其固體脂質(zhì)納米粒的制備三個方面來對 HHO進(jìn)行研究，為魚腥草作為一種新的抗腫瘤中藥的研究提供科學(xué)依據(jù)。
　　1. HHO體外誘導(dǎo)SUDHL-4細(xì)胞凋亡研究
　　采用 CCK-8法檢測 HHO作用后細(xì)胞的生長抑制率，F(xiàn)ITC-Annerxin V/PI雙染法和 PI單染法分別檢測 HHO作用后細(xì)胞凋亡率和周期變化，光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察 HHO

4、作用后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和凋亡狀態(tài)，最后通過磷酸化抗體芯片來研究HHO誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡通路。
　　CCK-8法結(jié)果表明，HHO對 SUDHL-4細(xì)胞有明顯的抑制作用且有時間和濃度依賴性。24h的抑制率最高達(dá)77.55%，IC50為0.3198μL/mL；作用48h的抑制率最高達(dá)84.35%， IC50為0.2329μL/mL；作用72h的抑制率最高達(dá)90.94%，IC50為0.2001μL/mL,各組間具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。用

5、濃度分別為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30μL/mL的 HHO誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞 SUDHL-4，48h后細(xì)胞凋亡率可分別達(dá)到（5.95±1.35）%、（13.12±0.28）%、（27.15±0.55）%、（36.35±0.93）%、（76.68±1.01）%、（96.37±0.87）%。周期結(jié)果表明HHO能將SUDHL-4細(xì)胞阻滯于G2/M期，推測HHO抑制細(xì)胞生長的機(jī)制可能與阻礙G2/M期DNA和蛋白質(zhì)的合成有關(guān)。不同

6、濃度的HHO作用于SUDHL-4細(xì)胞48h后，在光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，且細(xì)胞數(shù)目變少，具有濃度依賴性；熒光顯微鏡下觀察，碎片狀的紅綠色細(xì)胞和胞膜破壞的橙紅色細(xì)胞隨著濃度的增大越來越多，說明凋亡和壞死細(xì)胞逐漸增多，HHO可以促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞SUDHL-4的凋亡。運用磷酸化蛋白芯片技術(shù)，用CSP100芯片識別多條信號通路中關(guān)鍵蛋白的抗體，得到給藥組和空白組的差異，通過選擇樣本間差異磷酸化位點和其調(diào)變倍數(shù)，映射到 HHO促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞凋

7、亡的關(guān)鍵蛋白 Bcl-2和關(guān)鍵分支信號通路為 Raf―MEK1/2―ERK1/2―Bcl-2，為 HHO的抗淋巴瘤方面的機(jī)制研究提供了有效的科學(xué)依據(jù)。
　　2． HHO體內(nèi)藥效學(xué)研究
　　建立 SUDHL-4淋巴瘤荷瘤腫瘤模型，將小鼠隨機(jī)分為5組：陽性對照長春新堿1mg/kg組、HHO230mg/kg、150mg/kg、HHO70mg/kg組及陰性對照組。治療期間每天測量瘤體大小，治療結(jié)束后將腫瘤及組織剝離，稱量瘤重并計算抑

8、瘤率，并對腫瘤及組織進(jìn)行HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　結(jié)果表明，HHO對于淋巴瘤有明顯抑制作用，且具有濃度依賴性。隨著HHO濃度的增加，藥物對淋巴瘤的抑制率也不斷增加，最高可達(dá)到51.82%。腫瘤切片表明，與陰性組比較，腫瘤細(xì)胞隨著濃度的增加，細(xì)胞間隙越來越大，結(jié)構(gòu)輪廓越來越模糊，周圍結(jié)締組織生長，說明 HHO對于淋巴瘤有生長抑制作用且長春新堿組對于淋巴瘤有明顯的抑制作用。小鼠內(nèi)臟切片表明，低濃度時給藥時,小鼠的肝臟出現(xiàn)病理變

9、化，而高濃度給藥時，肝臟和脾臟都出現(xiàn)了不同程度的病理變化，說明 HHO經(jīng)腹腔注射給藥時對小鼠的肝臟和脾臟有損傷。
　　3．制備魚腥草揮發(fā)油-固體脂質(zhì)納米粒
　　采用熔融超聲乳化法制備魚腥草揮發(fā)油固體脂質(zhì)納米粒（Volatile oil from Houttuyniae Herba- Solid lipid nanopartcles，HHO-SLN）,經(jīng)過單因素考察，正交試驗來篩選最佳制備工藝和最優(yōu)處方,并從外觀形狀、粒徑電位

10、分布、包封率、載藥量和穩(wěn)定性等方面對 HHO-SLN進(jìn)行制劑學(xué)評價。最終優(yōu)化制備工藝處方為：單硬脂酸甘油酯用量為0.25%，復(fù)合乳化劑用量為3%，泊洛沙姆和蛋黃卵磷脂的用量比例為3:1，用藥量為1%，吐溫80用量為0.5%。恒溫磁力攪拌下緩慢地將水相加入相同溫度的油相中，均勻攪拌20min后制成初乳，將初乳超聲分散15min，振幅100%，室溫自然冷卻后用0.22μm微孔濾膜過濾，濾液即為HHO-SLN。
　　制得的 HHO-SL

11、N呈規(guī)則圓球形，粒徑較小，分布均勻，平均粒徑為（42.89±2.13）nm,粒徑在10nm-100nm之間的納米粒總量占全部納米粒的比例為91.8%，平均 Zeta電位為（?20.4±0.78）mv,體系比較穩(wěn)定均一。包封率載藥量分別為（91.49±2.40）%、（6.08±0.42）%。穩(wěn)定性實驗表明，高溫強(qiáng)光照都會影響制劑的穩(wěn)定性，使粒徑增大，包封率降低。初步穩(wěn)定性試驗表明， HHO-SLN應(yīng)該避光密封保存在4℃條件下，才能保持制劑