利用硫氧還蛋白還原酶對卷煙毒理特征的初探.pdf

1、吸煙是被公認(rèn)為引起很多疾病的重要因素，尚不能戒煙人群宜使用低危害卷煙。煙氣中成分及其復(fù)雜，含有超過5600種的化學(xué)成分，其中158種已被確認(rèn)對人體有危害，同時也存在很多因素可以影響煙氣中可吸入到人體內(nèi)的有害物質(zhì)的成分及含量，例如煙草的加工方式、煙葉的干燥程度、卷煙的儲存環(huán)境、煙葉的品種及培養(yǎng)條件和卷煙過濾嘴的材料等等，這些因素加在一起使得卷煙的安全性評價操作非常復(fù)雜?，F(xiàn)階段卷煙危害性評價主要依賴化學(xué)成分分析及細(xì)胞毒評價方法。由于煙氣成分

2、極其復(fù)雜，不同有害成分往往此消彼漲，依賴于幾類物質(zhì)評價有一定局限性。另一方面，細(xì)胞毒的評價方法實驗周期長、成本高，不可能進(jìn)行多種卷煙比較，不具有高通量的特性。綜上，低危害卷煙研發(fā)需要高通量的評價方法。
　　硫氧還蛋白（Trx）系統(tǒng)在機(jī)體中在促進(jìn)細(xì)胞增殖、維持氧化還原平衡及抑制細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮著重要作用，它主要由Trx、硫氧還蛋白還原酶（TrxR）和磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）組成。TrxR是一種二聚體含硒酶，因在TrxR

3、蛋白結(jié)構(gòu)表面含有獨特的硒半胱氨酸基團(tuán)（Sec），其化學(xué)反應(yīng)非?；顫?易被眾多親電子化合物修飾并失活；卷煙煙氣中含有多種如丙烯醛等不飽和親電子化合物，可與TrxR快速發(fā)生反應(yīng)，故我們猜測卷煙煙氣提取液（CSE）能夠抑制TrxR活力，不同卷煙所制CSE抑制TrxR活力的能力不同。結(jié)果表明，TrxR是CSE敏感靶蛋白，CSE可迅速、劑量依賴地抑制小鼠肝勻漿TrxR活力；在所比較18種卷煙中，CSE抑制小鼠肝勻漿TrxR活力可達(dá)2.6倍不同；通

4、過在人舌鱗癌細(xì)胞（Tca8113）、結(jié)腸癌細(xì)胞（CT-26）、大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）、肝癌細(xì)胞（HepG2）四種細(xì)胞進(jìn)行CSE的細(xì)胞毒分析，我們發(fā)現(xiàn)抑制TrxR能力強(qiáng)的CSE具有高細(xì)胞毒性，三種CSE在四種細(xì)胞模型上均劑量依賴地產(chǎn)生細(xì)胞毒性，且不同模型、不同CSE濃度情況下均顯示具有高TrxR抑制能力的CSE能產(chǎn)生較嚴(yán)重的細(xì)胞毒性。細(xì)胞毒方法已被廣泛用于評價卷煙安全性，但是復(fù)雜的操作步驟和較長的實驗周期等特點使得細(xì)胞毒方法并不能

5、適用于同時比較多個卷煙樣品。相對于細(xì)胞毒評價，本方法具有簡單、快捷、準(zhǔn)確及可實現(xiàn)高通量等特性，并且可以作為一種很好的預(yù)測卷煙細(xì)胞毒性的輔助方法，本研究方法可促進(jìn)煙草行業(yè)深入研究農(nóng)業(yè)與工業(yè)措施對卷煙危害性的影響，從而加速低危害卷煙的研發(fā)進(jìn)程。
　　為了進(jìn)一步探究CSE作用于Trx系統(tǒng)的機(jī)理，本文在Tca細(xì)胞層面上進(jìn)行了一系列的毒理分析，具體操作方法為Tca細(xì)胞分別與含1.5％或3%的CSE孵育2小時，收集并破碎細(xì)胞，收取上清液并進(jìn)行

6、指標(biāo)檢測，發(fā)現(xiàn)CSE干預(yù)Trx系統(tǒng)主要通過如下幾個方式：CSE中的不飽和親電子化合物可快速與Sec結(jié)合并烷化TrxR蛋白；CSE的干預(yù)使得細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生氧化逆境進(jìn)而促進(jìn)TrxR蛋白發(fā)生交聯(lián)作用，降低TrxR的活性；CSE中的不飽和親電子化合物可與Trx中的活性巰基結(jié)合烷化Trx蛋白；CSE的干預(yù)使得細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生氧化逆境進(jìn)而使Trx發(fā)生氧化。通過以上結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)CSE可全方位的作用于Trx系統(tǒng)，使得Trx系統(tǒng)的維持氧化還原平衡能力以及促進(jìn)

7、細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡等作用大打折扣，對細(xì)胞乃至于機(jī)體造成損傷，進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞或者組織病變甚至致癌等效果。
　　通過借助小鼠肺部滴注技術(shù)，我們實現(xiàn)了CSE直接接觸活體小鼠肺部組織，進(jìn)而在體外研究的形式下觀察CSE對小鼠肺部組織的影響。具體操作方法為首先配置較高濃度CSE，實驗小鼠共分3組，一組滴注CSE，一組滴注生理鹽水，一組不做滴注處理作為對照，所需滴注的處理小鼠每隔一天滴注一次，共滴注五次，在最后一次滴注操作后24小時處死小鼠，

8、并取肺部組織做成勻漿液和切片，進(jìn)而進(jìn)行指標(biāo)分析。結(jié)果表明，本實驗所用的CSE滴注劑量并沒有降低肺部組織中TrxR的活力水平，也沒有促進(jìn)TrxR蛋白在肺部組織的積累，但是在肺部切片水平上，我們發(fā)現(xiàn)滴注CSE處理的小鼠肺部組織明顯出現(xiàn)損傷，與對照組與滴注生理鹽水組相比，病變整體較嚴(yán)重，肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張充血、出血，有纖維素、炎性細(xì)胞滲出，肺泡破裂、出血、變形嚴(yán)重。通過對肺部組織mRNA進(jìn)行熒光定量PCR分析并篩選，我們發(fā)現(xiàn)與對照組和滴注生理