分子信標(biāo)技術(shù)在生物酶和ATP等重要生物分子檢測中的應(yīng)用.pdf

1、生物酶和ATP等重要生物分子是生物體和生命現(xiàn)象的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和功能基礎(chǔ)，在物質(zhì)代謝、機體防御、血液凝固、肌肉收縮、細(xì)胞信息傳遞、個體生長發(fā)育、組織修復(fù)等方面發(fā)揮著不可替代的重要作用，它們的含量和活性直接關(guān)系到生物體的健康。因此，深入研究這些生物分子之間的相互作用，特別是建立這些生物分子快速、簡便、準(zhǔn)確、靈敏的分析方法，對分子水平上闡明生命的奧秘、新型藥物的開發(fā)，攻克許多疑難病癥以及促進信息科學(xué)的發(fā)展都有重要的意義，是當(dāng)前生物分析化學(xué)研究的前

2、沿和熱點。 本論文以上述科學(xué)問題為目標(biāo)，結(jié)合當(dāng)前發(fā)展的核酸探針技術(shù)和分子生物學(xué)手段，巧妙地利用了核酸酶(連接酶或聚合酶)、核酸以及分子信標(biāo)核酸探針的特殊性質(zhì)，發(fā)展了激酶、磷酸酶和限制性內(nèi)切酶等生物酶活性實時檢測的新方法。更重要的是，首次將分子信標(biāo)探針用于三磷酸腺苷(ATP)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)等重要生物小分子的檢測。主要內(nèi)容歸納如下： 首先，拓展了NTFS平臺技術(shù)的應(yīng)用，

3、將其用于ATP、NAD、NADP、肌酸激酶、蛋白激酶等重要生物分子的檢測，具體包括以下六個部分： 1、分子信標(biāo)技術(shù)結(jié)合T4 DNA連接酶用于ATP的檢測。利用T4 DNA連接酶對ATP的高度依賴性，我們發(fā)展了一種ATP檢測新方法。在ATP存在的條件下，T4 DNA連接酶以分子信標(biāo)為模板，將兩段短核酸片段連接，連接產(chǎn)物將分子信標(biāo)打開，熒光信號增強，從而達到檢測ATP的目的。該方法靈敏，簡單，其線性響應(yīng)范圍為1～300 nM，檢測下

4、限為0.14 nM。并利用該方法對細(xì)胞內(nèi)的ATP水平進行了初步分析。 2、分子信標(biāo)技術(shù)用于肌酸激酶活性的檢測。二磷酸腺苷(ADP)與磷酸肌酸在肌酸激酶催化作用下生成肌酸和ATP，由于T4 DNA連接酶對ATP的高度依賴性，T4 DNA連接酶就會識別并利用生成的ATP進行DNA連接反應(yīng)，產(chǎn)生的長鏈DNA將分子信標(biāo)打開，使熒光信號增強，達到檢測肌酸激酶活性的目的。其線性響應(yīng)范圍為1～50U/L，檢測下限為0.64U/L。并用此方法考

5、察了藥物對CK活性的影響。該方法快速、簡便、靈敏度高。 3、分子信標(biāo)技術(shù)用于蛋白激酶A活性的檢測。以蛋白激酶A為模型，通過測定蛋白激酶催化后所剩余的ATP的量來檢測蛋白激酶的活性。T4 DNA連接酶和分子信標(biāo)底物被用于ATP的檢測，其線性響應(yīng)范圍為12.5～150 nM，檢測下限為1.25 nM。并考察了藥物染料木素對蛋白激酶A的抑制作用。該方法不用進行同位素標(biāo)記、操作簡便、具有通用性。 4、分子信標(biāo)結(jié)合酶信號放大檢測A

6、TP。結(jié)合連接酶、腺苷酸激酶和核苷二磷酸激酶對ATP進行了檢測。連接反應(yīng)消耗ATP生成單磷酸腺苷(AMP)，AMP與三磷酸脫氧胞苷酸(dCTP)在腺苷酸激酶的催化下生成ADP和2-脫氧胞苷5-二磷酸(dCDP)，ADP和dCTP在核苷二磷酸激酶催化下生成ATP，使得ATP得到循環(huán)。利用T4 DNA連接酶對ATP的高度依賴性，ATP的不斷產(chǎn)生使得被打開的分子信標(biāo)不斷增加，檢測的線性范圍為0.01～10 nM，檢測下限為5 pM，與最靈敏的

7、ATP檢測方法生物發(fā)光法的靈敏度相當(dāng)。 5、基于分子信標(biāo)的NAD高靈敏檢測方法。本章利用大腸桿菌DNA連接酶對NAD的高度依賴性，發(fā)展了一種NAD檢測新方法。在NAD存在的條件下，大腸桿菌DNA連接酶被激活，并以分子信標(biāo)為模板，將兩段短核酸片段連接，連接產(chǎn)物將分子信標(biāo)打開，熒光信號增強，從而達到檢測NAD的目的。該方法靈敏，簡單，其線性范圍為0.3～40nM及40～300 nM，檢測下限為0.3 nM。并利用該方法考察了卡路里限制對MC

8、F7細(xì)胞內(nèi)NAD水平的影響。 6、基于分子信標(biāo)的NADP高靈敏檢測方法。首先利用堿性磷酸酶將NADP的磷酸根切除轉(zhuǎn)化生成NAD，然后將NAD加入到分子信標(biāo)及大腸桿菌DNA連接酶連接體系中進行檢測，通過記錄并計算熒光增強的初速度來定量，檢測的線性范圍為5～200 nM，檢測下限為2 nM。這是一種簡單、快速、高靈敏度的NADP分析新方法，且具有良好的特異性。 其次，對NTFS平臺技術(shù)進行了改進，基于聚合酶延伸反應(yīng)發(fā)展了一種

9、更簡便快速的用于實時研究核酸與蛋白質(zhì)(酶)相互作用的新技術(shù)，主要包括以下四個部分： 7、分子信標(biāo)用于DNA聚合酶活性的實時監(jiān)測。研究聚合酶活性的傳統(tǒng)方法主要是放射性同位素標(biāo)記結(jié)合凝膠電泳，操作復(fù)雜費時，并且不能提供實時信息。本章利用分子信標(biāo)技術(shù)，建立了一種簡單、快速、靈敏地實時監(jiān)測聚合酶活性的方法。其線性響應(yīng)范圍為0.003～6.25 U/mL,檢測下限為0.003 U/mL。并探討了聚合酶抑制劑對酶活性的影響，為以聚合酶為作用

10、靶標(biāo)的新藥開發(fā)及篩選提供了一種新的思路。 8、分子信標(biāo)用于核酸3’端去磷酸化過程的實時監(jiān)測。利用分子信標(biāo)技術(shù)，結(jié)合DNA聚合酶發(fā)展了一種核酸3’端去磷酸化實時監(jiān)測方法，建立了T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)的酯酶活性分析新方法。其線性響應(yīng)范圍為0.1～15 U/mL，檢測下限為0.1 U/mL。并探討了酶抑制劑對T4 PNK酯酶活性的影響，為T4 PNK抑制劑篩選提供了新的思路和方法。 9、分子信標(biāo)用于限制性內(nèi)切酶活性

11、的實時監(jiān)測。傳統(tǒng)的檢測限制性內(nèi)切酶活性的方法是不連續(xù)的，費時的。本章利用分子信標(biāo)技術(shù)，建立了一種簡便快捷、靈敏地連續(xù)監(jiān)測限制性內(nèi)切酶活性的方法。其線性響應(yīng)范圍為1～250 U/mL，檢測下限為1U/mL。并探討了限制性內(nèi)切酶抑制劑對酶活性的影響，為以限制性內(nèi)切酶為作用靶標(biāo)的新藥開發(fā)及篩選提供了新的手段。 10、分子信標(biāo)用于堿性磷酸酶活性的分析。利用分子信標(biāo)技術(shù)，建立了一種簡單、快速、靈敏地監(jiān)測磷酸酶活性的新方法，首次利用DNA作