芳香族污染物降解菌YC--RL1的趨化特性及降解基因bphC的功能研究.pdf

1、從長(zhǎng)期受芳香族化合物污染的活性淤泥中分離篩選到一株以該類物質(zhì)為碳源和能源的高效降解菌，經(jīng)鑒定其為節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.）細(xì)菌，并命名為YC-RL1。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室前期大量研究證明，該菌株具有廣泛的底物譜，可實(shí)現(xiàn)對(duì)大多數(shù)芳香族化合物如苯酚類和多氯聯(lián)苯等的生物降解。
　　微生物的趨化性系統(tǒng)可以使其游向或游離某類化合物，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)該類物質(zhì)的降解或避免其對(duì)菌體的毒害作用以使自身得以更好的生長(zhǎng)。為更好的理解實(shí)驗(yàn)菌株YC-RL

2、1的趨化性在對(duì)底物降解過程中的作用，以對(duì)硝基苯酚為趨化物，通過平板趨化性、土壤趨化性以及毛細(xì)管趨化性實(shí)驗(yàn)等對(duì)該菌株的趨化特性進(jìn)行了研究;同時(shí)，通過模擬土壤原位修復(fù)作用探究了菌株在實(shí)際應(yīng)用中的效果。高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果顯示，菌株YC-RL1可在72 h內(nèi)降解約99％以上的對(duì)硝基苯酚。一系列趨化性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株YC-RL1在以對(duì)硝基苯酚為底物時(shí)具有明顯的趨化特性，而且當(dāng)對(duì)硝基苯酚濃度在一定范圍內(nèi)(5～800 mg/L)時(shí)，菌株的趨化性與

3、對(duì)硝基苯酚濃度呈正相關(guān)，當(dāng)其高于800 mg/L時(shí)，菌株的趨化特性則逐漸受到抑制。土壤原位修復(fù)模擬結(jié)果顯示，未滅菌土壤中對(duì)硝基苯酚的降解速率高于滅菌后土壤中的降解速率，在14d內(nèi)其降解率可達(dá)95％。研究表明，該菌株對(duì)環(huán)境具有良好的適應(yīng)性，在對(duì)污染環(huán)境的修復(fù)過程中也具有重要的應(yīng)用價(jià)值與潛力。
　　進(jìn)一步通過對(duì)Arthrobacter sp.YC-RL1中多氯聯(lián)苯降解關(guān)鍵基因bphC的克隆與原核表達(dá)，鑒定了其編碼的2，3-二羥基聯(lián)苯-

4、1，2-雙加氧酶BphC的酶活特性與功能。以菌株YC-RL1全基因組為模板通過PCR擴(kuò)增bphC基因全長(zhǎng)，并構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)后進(jìn)行原核表達(dá);根據(jù)親和層析原理對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化并分別測(cè)定該酶在不同條件下對(duì)底物2，3-DHBP的催化特性，確定其最適反應(yīng)pH與溫度以及不同金屬離子對(duì)酶活特性的影響，并根據(jù)擬合的米氏方程對(duì)該酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，bphC基因表達(dá)所得重組蛋白經(jīng)純化后仍具有體外活性，其最

5、適pH與溫度分別為pH7.4和30℃，且部分金屬離子如Fe2+，Cu2+以及Cd2+等均可促進(jìn)BphC酶活。經(jīng)計(jì)算，該酶的酶促動(dòng)力學(xué)常數(shù)分別為Km:8.67 mmol/L; Vmax:27.32μmol/s; kcat:15.55 s-1;kcat/Km:1.79 mmol/s，同時(shí)利用bphC編碼的氨基酸序列分析及3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分子對(duì)接模擬對(duì)該酶的特性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明BphC酶對(duì)底物2，3-DHBP具有較高的親和性與酶解作用。