液體核磁共振及生物光譜學方法研究hUBF HMG BOX-5蛋白質(zhì)體外折疊，穩(wěn)定性，及熱力學中間態(tài)系綜.pdf

1、生物學中的一個仍然未解決的基本問題就是：蛋白質(zhì)內(nèi)部不同層次的相互作用是如何決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和折疊過程?；卮疬@個問題需要我們用不同的實驗技術(shù)在不同的層次上詳細地研究蛋白質(zhì)折疊過程和可能存在的平衡中間態(tài)的構(gòu)象和動力學情況。一些模式蛋白質(zhì)的折疊過程屬于兩態(tài)折疊平衡，其不同結(jié)構(gòu)單元只表現(xiàn)為一個協(xié)同變化過程。然而另外一些蛋白卻有更加復雜的折疊平衡過程，在折疊過程中有穩(wěn)定的中間態(tài)出現(xiàn)。其中平衡中間態(tài)被廣泛的認為就是體外蛋白質(zhì)折疊過程中應有的動

2、力學(Kinetics)中間態(tài)，或者是體內(nèi)的非天然構(gòu)象產(chǎn)物。近些年來關于平衡中間態(tài)的構(gòu)象和動力學研究已取得了重要的進展。
　　 本論文工作的重點包括如下兩個部分：(1)用NMR spectroscopy(核磁共振波譜)，DSC(差示掃描量熱)，CD spectroscopy(圓二色光譜)，F(xiàn)luorescencespectroscopy(穩(wěn)態(tài)熒光光譜)以及Stopped-Flow(快速混合停流)這五種實驗方法在不同的角度詳細地研

3、究了Box-5蛋白質(zhì)的可逆三態(tài)去折疊過程。我們第一次發(fā)現(xiàn)了Box-5蛋白質(zhì)在55℃時存在一個熱力學折疊中間態(tài)系綜，并用如上方法對這個中間態(tài)的構(gòu)象和主鏈動力學做了透徹的分析。我們的實驗結(jié)果暗示了一個Box-5蛋白質(zhì)的helix-turn-helix(HTH)柔性折疊模型。具體的講就是在Box-5蛋白質(zhì)的折疊過程中，先由螺旋1和螺旋2在中間態(tài)中形成helix1-turn-helix2范式，然后兩個疏水折疊核心形成并進一步促成了螺旋3的形成。

4、這個helix-turn-helix(HTH)柔性折疊模型是第一次在HMG Box蛋白質(zhì)家族中被發(fā)現(xiàn)。(2)人源Sox-4蛋白質(zhì)的HMG結(jié)構(gòu)域的基因克隆，表達純化,NMR溶液結(jié)構(gòu)以及其與14bp雙鏈DNA特異性相互作用的研究。
　　 第一章是對離體條件下蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和折疊研究的一個綜述。簡要的介紹了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性理論以及蛋白質(zhì)折疊的傳統(tǒng)理論模型。著重介紹了近些年國際上關于蛋白質(zhì)折疊的各種狀態(tài)及蛋白質(zhì)折疊機理研究的新觀點.最后我們

5、介紹了近幾年研究蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，折疊和功能關系的幾個實例。但是沒有包括蛋白質(zhì)折疊的重要方面：細胞內(nèi)蛋白質(zhì)折疊。
　　 第二章是關于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和折疊研究方法的一個綜述。我們介紹了本論文工作所涉及的量熱法(DSC)，生物光譜學方法，快速停流(Stopped-Flow)方法以及液體核磁共振波譜(NMR)方法。其中對NMR方法研究平衡條件下蛋白質(zhì)非天然態(tài)的構(gòu)象和動力學內(nèi)容做了詳細的介紹。如，各種NMR參數(shù)(CSI，NOE，PRE，RDC

6、等)的介紹，以及譜密度函數(shù)作圖分析方法(Spectral density mapping)研究非天然態(tài)蛋白質(zhì)的主鏈動力學特征等。
　　 第三章是本論文的主要研究工作：Box-5蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和折疊的研究內(nèi)容及其實驗結(jié)果討論。DSC實驗表明Box-5蛋白質(zhì)從5℃到95℃的量熱掃描過程是可逆的兩個轉(zhuǎn)變過程。其中第一個轉(zhuǎn)變過程(N←→I)包括了30％的全部去折疊焓變，第二個轉(zhuǎn)變(I←→U)過程包括了其余的70％的全部焓變。生物光譜學實驗

7、表明Box-5蛋白質(zhì)的不同結(jié)構(gòu)單元在熱轉(zhuǎn)變過程中表現(xiàn)并不同步/協(xié)同，而且在55℃附近存在部分去折疊的熱力學中間態(tài)。這個中間態(tài)系綜包含有約82％的天然態(tài)二級結(jié)構(gòu)和大約65％的三級結(jié)構(gòu)，然而其主要疏水核心已經(jīng)暴露。不同實驗方法擬合得到的三態(tài)折疊熱力學參數(shù)都比較一致。核磁共振化學位移分析和相鄰殘基1HNi-1HNi+1 NOE分析表明螺旋1和螺旋2擁有天然態(tài)類似的二級結(jié)構(gòu)，螺旋3發(fā)生了部分去折疊。詳細的核磁共振主鏈馳豫動力學數(shù)據(jù)表明，在天然狀

8、態(tài)下，Box-5蛋白質(zhì)的整體運動相關時間(約9.5ns)和內(nèi)部運動相關時間(約1.1ns)有較大差異；相比較而言，在Box-5熱力學中間態(tài)系綜下，主鏈的動力學隨氨基酸殘基分布比較均勻，其擁有更快的整體運動相關時間(約4.7ns)和相似的內(nèi)部運動相關時間(約1.3ns)。NMR馳豫動力學數(shù)據(jù)計算的主鏈構(gòu)象熵變數(shù)據(jù)說明W14，W41，W52和Y63有最大的構(gòu)象熵增加，表明這些氨基酸殘基對天然態(tài)構(gòu)象穩(wěn)定性起主要貢獻.而V18，K27，A56，

9、以及C-端從M70到E84的氨基酸殘基有負的熵變，說明了這些氨基酸殘基在中間態(tài)中運動更加受限，其暗示這些氨基酸殘基可能參與了中間態(tài)系綜的非天然相互作用.此外,GdnHCl稀釋的Stopped-Flow實驗也檢測到了Box-5蛋白質(zhì)的折疊動力學(Kinetics)中間態(tài)的存在.我們的實驗結(jié)果暗示了一個Box-5蛋白質(zhì)的helix-turn-helix柔性折疊模型。具體的講就是在Box-5蛋白質(zhì)的折疊過程中，先由螺旋1和螺旋2在中間態(tài)中形成

10、了helix1-turn-helix2范式，然后兩個疏水折疊核心形成并進一步促成了螺旋3的形成。當然，這一折疊模型還有待近一步實驗證明。
　　 第四章的工作是關于人源Sox-4蛋白質(zhì)HMG結(jié)構(gòu)域的基因克隆，表達純化，NMR溶液結(jié)構(gòu)以及其與14bp雙鏈DNA特異性相互作用的研究。Sox基因的全稱是睪丸決定因子基因相關box基因(SRY(Sex-determining Region，Y chromosome).-related bo

11、x).Sox基因在早期胚胎發(fā)育過程中參與多種發(fā)育途徑，具有重要的功能.參與諸如性別決定、骨組織的發(fā)育、血細胞生成過程、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、晶狀體的發(fā)育等多種早期胚胎發(fā)育過程.Sox基因中的HMG結(jié)構(gòu)域長度約為79個氨基酸殘基，可以以序列特異性的方式與DNA的小溝結(jié)合，使其產(chǎn)生較大的彎曲，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達。我們的凝膠遷移率變動實驗證明了人源Sox-4 HMG蛋白質(zhì)特異性的識別5'-AACAAAG-3'雙鏈DNA序列.ITC實驗測定出Sox

12、-4 HMG蛋白質(zhì)與14bp雙鏈DNA的結(jié)合過程是熵驅(qū)動的，其解離常數(shù)是1.30*10-6 M，屬于中等強度的結(jié)合過程。NMR化學位移擾動實驗推測出Sox-4 HMG蛋白質(zhì)的一個側(cè)面上的一些帶電荷氨基酸，如H27,R38,H61和R56,構(gòu)成了其與DNA相互作用的潛在位點.NMR主鏈馳豫動力學實驗分析顯示Sox-4 HMG蛋白質(zhì)的Helix1和Helix2區(qū)域的氨基酸殘基在DNA結(jié)合后運動明顯變慢.DNA結(jié)合過程引起的Sox-4 HMG