蛹蟲草和蟬花組氨酸激酶基因的表達以及蛹蟲草組氨酸激酶蛋白檢測.pdf

1、組氨酸激酶是雙組份系統(tǒng)的重要部分，而雙組份系統(tǒng)是真菌感受外界刺激的重要機制，它使真菌能適應(yīng)和應(yīng)答環(huán)境的改變。蟬花和蛹蟲草是傳統(tǒng)的藥食兩用真菌，通過對其組氨酸激酶基因的研究，在理論上比較同為它們的組氨酸激酶基因的表達調(diào)控差異。
　　根據(jù)已知的蛹蟲草組氨酸激酶基因（CmHK）的序列來設(shè)計引物，對蟬花組氨酸激酶基因 IcHK進行克隆，克隆獲得的序列經(jīng)過測序、比對，最終獲得了IcHK基因的開放閱讀框（ORF）序列，全長為2811bp。對序

2、列進行分析表明，IcHK基因可編碼963個氨基酸殘基，它的翻譯產(chǎn)物IcHK有4個HAMP功能域、1個HisKA功能域、1個HATPase_c功能域和1個REC功能域。
　　長期以來，對組氨酸激酶的研究主要聚焦在它對外界信號的表達調(diào)控上，且近年來有關(guān)殺真菌劑表達調(diào)控的研究頗多。采用實時熒光定量PCR方法研究了三種殺真菌劑（咯菌腈、異菌脲和克菌丹）對蛹蟲草組氨酸激酶CmHK和蟬花組氨酶激酶IcHK表達的影響。結(jié)果表明，CmHK基因和I

3、cHK基因?qū)@三種殺菌劑的敏感性均有所不同：這三種殺菌劑不能導(dǎo)致CmHK基因的相對轉(zhuǎn)錄量明顯增加，因此CmHK基因的表達對這三種殺菌劑的影響不敏感；而它們都可導(dǎo)致IcHK基因的相對轉(zhuǎn)錄量的增加，說明IcHK基因的表達對這三種殺菌劑的影響都敏感，尤其對咯菌腈和克菌丹更為敏感。
　　針對已獲得的蛹蟲草組氨酸激酶基因，設(shè)計兩種方法來制備抗體，一種方法是通過原核表達CmHK基因的部分序列獲得融合表達蛋白，并以此作為抗原制備抗體。依據(jù)CmH

4、K基因ORF序列及其功能域分析，將其分為兩段（CmHK1和CmHK2）分別設(shè)計引物，將PCR獲得的CmHK1和CmHK2兩個部分序列分別連接表達載體pET-41a（+），最終轉(zhuǎn)化到BL21（Escherichia coli）受體細胞，以構(gòu)建CmHK1和CmHK2的原核表達系統(tǒng)。利用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白的表達，并使用ProteinIsoTM Ni-NTA Resin純化表達蛋白。純化的融合蛋白CmHK1和CmHK2作為抗原免疫家兔后獲得了

5、兩種抗體anti-CmHK1和anti-CmHK2。另一種方法是化學(xué)合成CmHK抗原決定簇短肽，偶聯(lián)載體蛋白后作為抗原制備抗體?；瘜W(xué)合成三條短肽HK3、HK4和HK5后，分別與BSA偶聯(lián)作為抗原制備了三種抗體 anti-HK3、anti-HK4和 anti-HK5。將這兩種方法獲得的抗體通過Western blotting方法檢測CmHK在蛹蟲草中的存在形式。Western blotting分析發(fā)現(xiàn)只有 anti-CmHK2沒有出現(xiàn)特異