基于脫氧核酶的熒光探針用于細(xì)胞內(nèi)鋅、銅離子的檢測(cè)及成像.pdf

1、在生物體內(nèi)，金屬離子普遍參與生命過程，在許多生理過程中發(fā)揮著非常重要的作用。在這些金屬離子中，鋅離子作為人類生活中不可缺少的微量營養(yǎng)素，在基因的轉(zhuǎn)錄和神經(jīng)信號(hào)的傳輸中擔(dān)任著非常重要的角色。除此之外，鋅離子也是很多酶和蛋白質(zhì)的重要組成部分；銅離子作為另外一種具有高反應(yīng)活性的金屬離子，在線粒體呼吸鏈中起著重要的作用，低水平的銅對(duì)許多生理活動(dòng)有著重要的影響，如酶的調(diào)節(jié)，新陳代謝和細(xì)胞的免疫功能，然而，也有數(shù)據(jù)顯示高水平的銅可以導(dǎo)致神經(jīng)紊亂、肝

2、臟和腎的紊亂，以及與神經(jīng)退行性疾病和朊病毒病有關(guān)。細(xì)胞作為一個(gè)多級(jí)的網(wǎng)絡(luò)信號(hào)通路結(jié)構(gòu)，在這個(gè)通路中，鋅離子和銅離子廣泛地對(duì)生理功能起著調(diào)節(jié)作用，它們彼此之間相互作用、相互影響。因此，活細(xì)胞內(nèi)多種金屬離子的原位和實(shí)時(shí)檢測(cè)，不僅有利于我們進(jìn)一步理解與之相關(guān)的各種生物功能和重大疾病調(diào)控中多種金屬離子彼此關(guān)聯(lián)、互相影響的關(guān)系及它們共同作用的過程，而且對(duì)全面的認(rèn)識(shí)與多種金屬離子相關(guān)的各類生物事件和重大疾病具有重要意義，這也將為生物學(xué)以及醫(yī)學(xué)的研究

3、提供必要的依據(jù)。在目前已經(jīng)建立的測(cè)定金屬離子的方法中，雖然分子熒光成像法對(duì)于細(xì)胞內(nèi)鋅離子和銅離子的濃度和位置的檢測(cè)無疑是一種強(qiáng)有力的分析方法，而且基于有機(jī)熒光團(tuán)和納米材料的成像探針也已經(jīng)取得了很大進(jìn)步。但是，所有的熒光探針都只能單獨(dú)的區(qū)分細(xì)胞中的鋅離子和銅離子。到目前為止，對(duì)于單個(gè)細(xì)胞中鋅離子和銅離子的共同原位和實(shí)時(shí)檢測(cè)的探針還沒有出現(xiàn)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴設(shè)計(jì)和組裝了一種基于脫氧核酶修飾的納米金的雙色熒光探針，實(shí)現(xiàn)了對(duì)活

4、細(xì)胞內(nèi)Zn2+和Cu2+同時(shí)檢測(cè)及原位成像。該納米探針有以下幾部分組成：13 nm的AuNP；可特異性識(shí)別Zn2+和Cu2+的DNAzymes，DNAzymes的底物鏈分別標(biāo)記熒光團(tuán)和猝滅劑，其中熒光團(tuán)標(biāo)記在5’端，猝滅劑標(biāo)記在3’端。熒光團(tuán)的熒光可以被AuNP和猝滅劑猝滅。當(dāng)納米探針進(jìn)入到細(xì)胞里時(shí)，底物鏈將會(huì)在靶向物（Zn2+和Cu2+）的作用下斷裂，導(dǎo)致包含熒光團(tuán)的DNA片段分離出來，產(chǎn)生與細(xì)胞內(nèi)Zn2+和Cu2+濃度相關(guān)的熒光信號(hào)

5、。該納米熒光探針展現(xiàn)了高的特異性，核酸穩(wěn)定性和良好的生物兼容性。而且，該納米探針可以通過原位的方式同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的Zn2+和Cu2+，提供靶向物質(zhì)的位置和濃度的信息。這對(duì)于深遠(yuǎn)的理解與Zn2+和Cu2+相關(guān)的細(xì)胞生物事件和生物進(jìn)程有重要的意義。構(gòu)建的這種策略也對(duì)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)多種金屬離子有著潛在的應(yīng)用價(jià)值，可以幫助我們更好的理解金屬離子在生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞毒理學(xué)的相關(guān)功能。⑵發(fā)展了一種基于氧化石墨烯和脫氧核酶的活細(xì)胞內(nèi)金屬離子同時(shí)成

6、像的方法。該方法結(jié)合了雜交鏈反應(yīng)和氧化石墨烯，首次通過信號(hào)放大的方式檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Zn2+和Cu2+，并在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行高靈敏成像。以氧化石墨烯作為載體，發(fā)夾探針H1/H2和脫氧核酶負(fù)載于氧化石墨烯上，運(yùn)載到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)Zn2+和 Cu2+的作用下，脫氧核酶底物鏈斷裂，釋放出可以引發(fā)雜交鏈反應(yīng)的 DNA片段，產(chǎn)生與Zn2+和Cu2+濃度相關(guān)的熒光信號(hào)。該方法首次通過信號(hào)放大的方式高靈敏檢測(cè)并同時(shí)成像細(xì)胞內(nèi)的Zn2+和Cu2+，提供靶向物質(zhì)